Espectrometría de masa UV-MALDI: presente y futuro de una técnica analítica mágica.

ERRA BALSELLS, ROSA

Universidad Nacional de Lanús, Lanúa, Pcia de Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química,; 2010

Asociacion Quimica Argentina

ESPECTROMETRÍA DE MASA UV-MALDI: PRESENTE Y FUTURO DE UNA TÉCNICA ANALÍTICA MÁGICA Rosa Erra-Balsells CIHIDECAR-CONICET, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Pabellón II, 3er Piso, Ciudad Universitaria, 1428 - Buenos Aires, Argentina. e-mail:erra@qo.fcen.uba.ar        El uso de la espectrometría de masa (EM) como técnica analítica creció en forma exponencial desde que J. J. Thompson describiera en 1910 experimentos donde iones gaseosos producidos por bombardeo electrónico de especies gaseosas neutras eran separados según el valor de su relación m/z (m, masa y z carga del ión). Si bien este descubrimiento llevó a experimentos claves para la caracterización de isótopos estables (descubrimiento del deuterio, Premio Nobel de Química 1934, Harold Urey) y radionucleídos, las aplicaciones de esta técnica se vieron limitadas a compuestos de bajo peso molecular, termoestables y fácilmente volatilizables. Durante muchos años, la generación de moléculas gaseosas iónicas pasaba por dos etapas, la primera de volatilización del analito haciendo uso de calor y la segunda de ionización mediante el bombardeo del mismo con especies que lo ionizaran. De esta manera a la técnica de ionización por bombardeo con una haz de electrones acelerados (EI) siguió el bombardeo con un haz de moléculas gaseosas ionizantes (ionización química, CI) y también la exposición del analito gaseoso a la acción de un fuerte campo eléctrico que produce su ionización por efecto túnel (ionización por campo, FI).         Pese a la limitación de que la técnica era útil solo para analitos termoestables, la EM progresó constantemente desde su invención casi cien años atrás. El fuerte desarrollo se debió tanto a los avances tecnológicos por un lado (mejoras instrumentales: desarrollo de nuevos analizadores de iones gaseosos; desarrollo de nuevos detectores; aumento de la sensibilidad y rapidez de los experimentos; procesamiento de datos; banco de datos; etc.) como al avance en el conocimiento del comportamiento de los iones moleculares gaseosos (estabilidad; formas de descomposición o fragmentación).      Todos los espectrómetros de masa tiene en común que miden la relación m/z de iones gaseosos haciendo uso de campos eléctricos y/o magnéticos. La exacta medida de este valor para las moléculas gaseosas ionizadas del analito (ión molecular) dará información sobre su masa molar (peso molecular). Si además se induce la fragmentación del ión molecular, cada fragmento iónico será detectado con su propio valor de m/z. El conjunto de fragmentos formados es característico de cada analito y depende de su estructura química (“huella dactilar”). Por lo tanto, del análisis de los fragmentos obtenidos se obtiene información sobre la estructura química del analito en cuestión.      La imposibilidad de aplicación de la técnica a analitos termolábiles limitó durante muchos años el posible uso de la misma en el campo de las biomoléculas y macromoléculas. Se requería, previo al análisis, la preparación de derivados termoestables. La engorrosa preparación de los mismos, hacía que muy pocos se vieran atraídos por el su uso de esta técnica. Además, se requerían cantidades significativas de muestra para su manipuleo químico previo al análisis por EM.     En la década del 70 se describen los primeros experimentos exitosos donde moléculas termolábiles eran transformadas sin descomposición alguna y en un único paso a iones gaseosos. Estas técnicas de volatilización/ionización se denominan técnicas de desorción. Si bien estos métodos de ionización ampliaron el uso de la técnica a moléculas termolábiles y a macromoléculas, prácticamente su límite de aplicación es para analitos de peso molecular por debajo de 700-800 Da. En ese momento, una de las revistas más importante de espectrometría de masa todavía se llamaba J. Org. Mass Spectrom. Los principales usuarios de la técnica seguían siendo los químico orgánicos que trabajaban con analitos termoestables de peso molecular bajo (< 800 Da).    El progreso había sido notable, se median pesos moleculares  cercanos a 1kDa con alta resolución con aproximación en el cuarto decimal pero, el análisis de las grandes macromoléculas como moléculas intactas gaseosas ionizadas seguía siendo un deseo, un sueño.          Los intentos de usar un láser UV como fuente de energía para la provocar desorción se remonta a la década del 60. Se lo usó primeramente para realizar determinaciones de composición elemental y luego para la desorción de biomoléculas pequeñas, siendo el mayor problema experimental que el analito debía absorber los fotones del láser UV, generando como especie primaria un estado electrónico excitado. A partir del mismo muchos analitos reaccionan fotoquímicamente o en otros fotoquímicamente estables el exceso de energía vibracional residual en la molécula desorbida induce su fragmentación inmediata. Cualquiera de las dos posibilidades  imposibilitan el análisis del ión molecular gaseoso intacto como tal a fin de obtener el valor de su m/z y peso molecular. La idea de usar una fuente láser pulsada ya sea en la región UV-visible o en la región infrarroja (IR) para la desorción ya existía. Todos los laboratorios se afanaban en ese momento en realizar experimentos con el segundo tipo de fuente láser, ya que los órdenes de energía que se requieren para deformar la molécula e inducir su desorción los prove el láser IR. Sin embargo, el “hecho mágico” producto quizás en parte de la casualidad se comunica en un congreso en el año 1987.1  El Ing. Koichi Tanaka (Premio Nobel de Química 2002), quien realizó el experimento, en su exposición con motivo de la recepción del galardón, aclara que su falta de prejuicio sobre la imposibilidad práctica de volatilizar macromoléculas termolábiles por calentamiento lo llevo a usar como analitos polímeros (polietilenglicoles, PEG) y proteínas a las que mezcló con polvo metálico de una granulación especial (diámetro: decenas de nm) usando acetona, como medio para generar una mezcla sólida de analito+polvo metálico. Al transferir la suspensión sobre la superficie del portamuestras introducido en la cámara de ionización en alto vacío, la acetona se evaporaba y en realidad generaba sobre el porta muestra una muestra sólida heterogénea constituida por polvo metálico embebiendo al analito en estado sólido (como pasas en el budín). Este deposito heterogéneo al ser bombardeada por el láser UV de N2 produjo el resultado mágico, deseado y largamente esperado, de generar iones moleculares intactos gaseosos del analito macromolecular en cuestión (proteínas y polímeros sintéticos). Tanaka mostró que era posible con un láser de N2 generar los iones moleculares intactos. El había logrado el resultado deseado usando, entre otras cosas, un láser UV de baja energía (Laser de N2, lem 337nm), cuya radiación no era absorbida ni por las proteínas ni por el PEG, sólo por el polvo metálicos y esto era completamente inesperado. El sueño se hizo realidad, ”Las macromoléculas y las moléculas termolábiles vuelan”. Las actuales2,3 y futures aplicaciones de esta técnica se describirán durante la conferencia. Referencias. 1- K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida, Rapid Commun. Mass Spectrom.  1988, 2, 151-153. 2- R. Erra-Balsells, Del volar de las proteínas y de cómo lograrlo (Espectrometría de masa UV-MALDI), Química Viva, 2004, 3 (2), www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar 3- Y. Gholipour, S. L. Giudicessi, H. Nonami, R. Erra-Balsells, Anal. Chem. 2010, 82, 5518-5526.