Apareamiento de levaduras como modelo de fusión célula-célula.

VALENTINA SALZMAN; VALENTINA PORRO; MARIELA BOLLATI; PABLO S. AGUILAR

Congreso; 8vas Jornadas de la Sociedad de bioquímica y bilogía molecular (SBBM); 2013

La fusión de membranas es un proceso esencial para la vida de todo organismo eucariota. El apareamiento de células haploides de Sacharomyces cereviseae es un buen modelo para el estudio de la fusión célula-célula. Estas células están sexualmente diferenciadas (como MATα o MATa) y aparean espontáneamente formando zigotos diploides estables. Análisis genéticos han permitido identificar un número significativo de proteínas que intervienen en el proceso de fusión, sin embargo, los componentes claves aún no se conocen. Actualmente las medidas de la eficiencia de la fusión celular se basan en la cuantificación mediante microscopía de fluorescencia de pares fusionados, donde uno de los componentes del par expresa en el citosol una proteína fluorescente. Los pares que no pueden fusionar pueden lisarse o bien permanecer no fusionados con sus membranas celulares muy cerca una de otra. Si bien este método ha sido muy usado, consume mucho tiempo limitando tanto el número de eventos de fusión como la cantidad de cepas que pueden ser analizadas a la vez. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método basado en la ténica de citometría de flujo para cuantificar la fusión de levaduras. Un defecto en la fusión puede medirse mediante ésta técnica fácilmente ya que permite diferenciar pares fusionados, no fusionados y lisados. Para este propósito células haploides MATa y MATalfa marcadas con ConA conjugada a una proteína fluorescente son co-incubadas para permitir la formación de zigotos. Cada cepa sintetiza un fragmento de una proteína fluorescente que forma un fluoróforo exitable por complementación bi-molecular. Así, en este ensayo se mide la acumulación de cuatro poblaciones de células fluorescentes: triples positivas (pares fusionados), dobles positivas (pares no fuionados), y simples positivas (haploides a o alfa). A su vez, una modificación del ensayo permite cuantificar lisis. Con este nuevo método miles de pares pueden ser analizados en segundos, proporcionando datos precisos y reproducibles permitiendo por primera vez la cuantificación rápida de la fusión celular en levaduras.