DISEÑO DE UNA TÉCNICA DE LABORATORIO PARA DETECTAR FORMAS CIRCULARES DE DNA PROVIRAL CON 2- LTR DE HIV.

A. MUSTO; D. CHOUHY; G. ANDREANI; P. N. FERNÁNDEZ LARROSA; R.D. RABINOVICH; A. GIRI; L. A. MARTÍNEZ PERALTA

La Plata, Argentina

Congreso; 7° Congreso Argentino de SIDA; 2005

Objetivo: Durante la infección por HIV una vez que ingresa el virus a la célula se retrotranscribe el ARN viral de simple cadena a ADN de doble cadena el cual es transportado al núcleo donde la mayor parte se integra al ADN celular y otra parte se circulariza para formar episomas con 1-LTR o 2-LTR. Estas estructuras son considerados productos lábiles por lo que la presencia de ellos a nivel nuclear indicaría infección activa. Existen evidencias acerca de que cuando se trata de células como macrófagos, contrariamente, resultan ser estables. El objetivo de este trabajo consiste en diseñar una técnica sencilla de laboratorio para realizar la detección del ADN con 2-LTR como estimador del ADN no integrado. Materiales y Métodos: Se diseñaron cebadores sentido y antisentido conjugado este último en su extremo 5´ a biotina. Seguido a esto se realizó una desnaturalización e hibridación en fase líquida del producto de PCR biotinilado con una sonda específica conjugada con fluoresceína. Luego se procedió a la inmovilización de los híbridos en la microplaca sensibilizada con estreptavidina. Finalmente se detectaron los híbridos con el agregado de un anticuerpo antifluoresceina conjugado con peroxidasa, se agregó un sustrato cromogénico y se realizó la lectura espectrofotométrica a 450nm. Las muestras utilizadas para la detección de ADN no integrado provenían de células H9 en infección activa a distintas concentraciones. La purificación del ADN se llevó a cabo en estas muestras utilizando columnas de Qiagen. Como control positivo se utilizó una construcción con un plásmido con el fragmento de interés amplificado. Resultados: todas las muestras estudiadas resultaron positivas por esta técnica. Conclusiones: La forma de ADN extracromosómico con 2-LTR es la única que se puede discriminar de las otras formas de ADN del HIV porque posee dos regiones con LTR. Se pudo poner a punto la PCR seguida de la detección colorimétrica, resultando todas las muestras estudiadas positivas, ya que se trata de células H9 en infección activa.