Optimización de la técnica PMA-qPCR para evaluar viabilidad de Escherichia coli productora de toxina Shiga en hamburguesas de carne vacuna

REY, M.A.; CAP, M.; VAUDAGNA, S. R.; MOZGOVOJ, M.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; II Congreso Internacional de Zoonosis, IX Congreso Argentino de Zoonosis; 2018

Asociación Argentina de Zoonosis

El PMA (propidium monoazide) es un colorante que se intercala en el ADN bacteriano de las células muertas e inhibe su amplificación. Su selectividad se fundamenta en que la membrana bacteriana es impermeable al colorante por lo que sólo puede penetrar células cuyas membranas se encuentran comprometidas. Una vez en el interior de la célula, se une al ADN irreversiblemente intercalándose entre las bases y formando un complejo PMA-ADN por efecto de la fotoactivación con una fuente de luz azul LED. En este estado de unión, el ADN no puede amplificarse por PCR. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la técnica PMA-qPCR para evaluar viabilidad de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) en hamburguesas de carne vacuna.Para el ensayo se utilizaron 25 g de hamburguesas inoculadas con células de STEC: muertas (109UFC/ml), vivas (109UFC/ml) y mezclas de una única concentración de bacterias muertas (109UFC/ml) con tres concentraciones de bacterias vivas (109, 108 y 107 UFC/ml). Una alícuota de cada homogenato fue tratada con 3 concentraciones de PMA: 50, 75 y 100 µM, y se expuso 15 min a una luz LED azul para el proceso de fotoactivación. Luego, se procedió a la amplificación del gen stx2 por qPCR. En las hamburguesas inoculadas con células de STEC muertas y tratadas con PMA se observó un corrimiento del Ct (Cycle threshold) en 10 unidades con respecto a la misma muestra sin tratar con PMA. En las hamburguesas inoculadas con una mezcla de STEC vivas y muertas y tratadas con PMA se observó un corrimiento del Ct en 3 unidades con respecto a las mismas muestras sin tratar con PMA. En las muestras inoculadas sólo con células vivas, los Ct resultantes para todas las concentraciones de PMA usadas se mantuvieron constantes y similares a la muestra sin tratar con PMA, mostrando que el colorante no ingresó en dichas células. No se observaron diferencias significativas entre las 3 concentraciones de PMA utilizadas.El PMA retrasó considerablemente la señal correspondiente a las células muertas, pero no inhibió completamente su amplificación. El aumento en la concentración de PMA de 50 a 100 µM no fue suficiente para garantizar una inhibición completa. Con el fin de inhibir completamente la amplificación, se evaluaron las concentraciones 104 y 105 UFC/ml de bacterias muertas en cultivo puro adicionando PMA en concentración 50 y 100 µM. Con el inóculo de 104 UFC/ml tratado con 100 µM de PMA se vio inhibición completa de la amplificación. Dicha concentración será la utilizada en ensayos posteriores. De esta forma, inhibiendo por completo la amplificación de las bacterias muertas, la señal obtenida solo será atribuible a células vivas remanentes post tratamiento de inactivación.