Respuesta al citrato y al estrés ácido de L. diacetylactis subs. lactis biovar diacetylactis y estudio de la síntesis del B-glucano de Pediococcus parvulus 2.6

NIEVES GARCÍA-QUINTÁNS; MARÍA LAURA WERNING,; MARÍA DE LOS ANGELES CORRALES; PALOMA LÓPEZ

Oviedo

Otro; II REUNION DE LA RED ESPAÑOLA DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS; 2005

Abstract L. lactis es una bacteria que participa en diferentes fermentaciones lacteas y, aunque es una bacteria neutrofila, más del 90% del azúcar que metaboliza lo convierte en ácido láctico. Así, la respuesta de L. lactis a la acidificación del medio de cultivo afecta directamente a su crecimiento, y por tanto, a la calidad de los productos fermentados durante los procesos industriales. Nuestro grupo está caracterizando a nivel genómico, proteómico y metabólico la respuesta al estrés ácido  de la estirpe L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis CRL264 capaz de metabolizar citrato. Este proyecto está financiado por la Unión Europea y se realiza en colaboración con los grupos de la Dra. Helena Santos del Instituto de Biología Experimental y Tecnológica  (Portugal) y del Dr. Diego de Mendoza de la Universidad Nacional de Rosario (Argentina). El análisis proteómico global de cultivos crecidos en presencia de glucosa y citrato a pH extracelular neutro o ácido, reveló que los niveles de algunas de las enzimas  implicadas en el metabolismo del citrato y en la ruta de desaminación de la arginina (RDA) están afectadas por el pH. El análisis transcripcional de la expresión de los genes implicados en la conversión de citrato en compuestos de cuatro carbonos,  confirmó que la ruta biosintética de la acetoína es específicamente inducida por el estrés ácido.  Por otra parte, la activación de la RDA a pH ácido, observada a nivel proteómico y confirmada por análisis transcripcional y detección de síntesis de ornitina, provoca un incremento en la biomasa y una reducción del tiempo de duplicación de los cultivos. Este efecto parece ser debido al intercambio de arginina y ornitina, ya que la activación de la RDA no provoca alteración del metabolismo de la glucosa y del cometabolismo de la glucosa y el citrato. Estos resultados indican que la RDA al igual que el metabolismo del citrato contribuyen de forma  independiente al mantenimiento de la homeostasis bacteriana. Muchos de los exopolisacáridos (EPS) producidos por bacterias ácido lácticas mejoran la textura de leches fermentadas y otros productos. Sin embargo, los b-D-glucanos producidos por estas bacterias tienen efectos deletéreos en bebidas alcohólicas. Dicha alteración se conoce como “ahilado” y consiste en un aumento de la viscosidad que tiene lugar tanto en sidras, como en vinos y cervezas. Nuestro grupo está realizando una caracterización molecular y enzimática de la síntesis del b-D-glucano de  Pediococcus parvulus 2.6 aislado de sidras ahiladas en colaboración con los grupos de las Dras. Ana Irastorza y Mª Teresa Dueñas de la Universidad del País Vasco (San Sebastián), del Dr. Jesús Navas de la Universidad de Cantabria (Santander), el Dr. Juan Antonio Leal (CIB) y el Dr. Manuel Bernabé del Instituto de Química Orgánica (Madrid). El gen plasmídico gtf de Pediococcus parvulus 2.6 ha sido clonado y secuenciado. Un análisis por PCR en un panel de 76 estirpes de bacterias lácticas aisladas de sidra o de colecciones de cultivos tipo, mostró la presencia específica del gen gtf  en las estirpes productoras de homopolisacáridos del tipo b-D-glucano pertenecientes a los géneros Pediococcus, Lactobacillus y Oenococcus. La proteína GTF, producto del gen gtf, presenta homología con proteínas de membrana pertenecientes a la familia COG1215 de glicosiltranferasas. La proteína GTF ha sido expresada funcionalmente en Lactococcus lactis bajo el control de  promotores inducibles por maltosa o por nisina. Ensayos de actividad enzimática han revelado que las membranas aisladas de lactococos sobreproductores de GTF contienen una glicosiltransferasa que utiliza UDP-glucosa como sustrato de su actividad catalítica.  Ensayos de aglutinación y determinación tanto de los niveles de EPS en los sobrenadantes de cultivos como de la estructura del EPS purificado  indican que la proteína GTF confiere a L. lactis la capacidad de sintetizar y secretar el mismo b-D glucano(1-3) 2 sustituido que Pediococcus parvulus 2.6.