Participación de los receptores de IGF1 y de insulina en un modelo in vivo de persistencia folicular ovárica bovina inducida mediante progesterona y desarrollo de un modelo de persistencia in vitro en células de la granulosa bovina.

CATTANEO, ML; DÍAZ, PABLO U.; GAREIS, NC.; CHIARAVIGLIO, JA; ETCHEVERS, L; AMWEG, AN; REY, F; SALVETTI, NR; ORTEGA, HH; RODRIGUEZ, FM.

Jornada; VIII Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNL; 2020

En los sistemas de producción lechera, donde la salud animal es crítica para lograr una buena rentabilidad, alteraciones fisiológicas podrían conducir a una disminución de los índices reproductivos y en consecuencia una menor producción. Particularmente, la persistencia folicular se relaciona con mecanismos causales de la falla ovulatoria donde ocurre un crecimiento sostenido del folículo preovulatorio que no responde a estímulos hormonales y no logra ovular. Es por ello que la persistencia folicular constituye un evento determinante en la patogenia de trastornos reproductivos tales como la enfermedad quística ovárica (COD del inglés: cystic ovarian disease). Entre los componentes que contribuyen a esta enfermedad, existen alteraciones en factores intraováricos como el sistema IGF e insulina. En el ovario, IGF1 es crítico para el crecimiento del folículo dominante mientras que la insulina es importante para la maduración folicular. En estudios realizados en nuestro laboratorio determinamos alteraciones en la expresión de los receptores de insulina (IRβ)1 y de IGF1 (IGFR1)2 en animales con COD. Es por ello que postulamos como hipótesis del presente trabajo que una alteración en la expresión de los receptores de IGF1 y de insulina afecta la funcionalidad ovárica, conduciendo a una falla en la ovulación, la consiguiente persistencia folicular con posible establecimiento de COD. Para demostrarla, nos planteamos dos objetivos: (1) evaluar la expresión del IGFR1 y del IRβ en folículos ováricos bovinos de distintos estadios de persistencia para conocer el momento crítico de la alteración de su expresión (modelo in vivo); (2) desarrollar un modelo de cultivos de células de la granulosa bovinas con bajas concentraciones de progesterona (P4) para simular el modelo de persistencia (modelo in vitro) que nos permita evaluar la regulación de estos receptores que no se podría in vivo. Para el modelo in vivo se utilizaron vacas de la raza Holando Argentino sin alteraciones en su tracto reproductor. Los animales fueron sometidos a la sincronización de sus ciclos estrales mediante el protocolo adaptado G6G-Ovsynch3. Los animales del grupo control (C, n= 5) sólo recibieron el tratamiento G6G-Ovsynch. Los grupos experimentales con 0 (P0, n=5), 5 (P5, n=5), 10 (P10; n=5) y 15 días de persistencia (P15; n=5) además se trataron con dispositivos intravaginales de liberación lenta de P4 hasta los 0, 5, 10 y 15 días de persistencia folicular, respectivamente. Los animales fueron sometidos a ovariectomía bilateral en distintos tiempos, el grupo C en proestro (un día antes del día esperado de la ovulación) el P0 en el día esperado para la ovulación y a los 5 (P5), 10 (P10) y 15 (P15) días de persistencia folicular. En las muestras de ovario se realizó la técnica de inmunohistoquímica indirecta para la determinación de la expresión de IRβ y de IGFR1 siguiendo el protocolo descripto previamente por Hein y col1. Se cuantificó mediante análisis digital de imágenes (% de área marcada) con el programa informático IMAGE PRO PLUS. Se evaluó la expresión de los receptores en células de la granulosa y de la teca de folículos en crecimiento y en los diferentes estadios de persistencia folicular. Para el modelo in vitro se utilizaron ovarios de vacas Holando Argentino sin alteraciones visibles en su sistema reproductivo, obtenidas de la playa de faena de un frigorífico de la zona y trasladadas al laboratorio en solución fisiológica (9 g/l NaCl) a 37 °C. Luego se aislaron los folículos mayores a 8 mm provenientes de ovarios sin alteraciones macroscópicas visibles y con cuerpo lúteo menor a 3 cm (no activo, en regresión). De estos folículos se obtuvo el LF con células de la granulosa (CG) mediante repetidos lavados con jeringa y aguja (flushing). El LF conteniendo las CG se centrifugó a 500g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en medio de cultivo adecuado (DMEM F-12, BSA 0.1%, NaHCO3 2mg/ml, insulina 0.01ng/ml, antibiótico-antimicótico 1X, FSH=PMSG 1Ul/ml), y fueron sembradas en placas de 24 pocillos. Se mantuvieron en el medio de cultivo suplementado con 20 ng/ml de P4 durante 24, 48 y 72 h en atmosfera con 5% CO2. Para cada tiempo se incluyeron células control mantenidas en medio de cultivo sin P4. Luego se obtuvieron las células y se centrifugaron a 800g durante 7 minutos. El sobrenadante se utilizó para mediciones hormonales y el pellet de células para la obtención de ARN mediante la técnica de Trizol1,2. Se realizó una retrotranscripción para obtener ADNc1,2, el cuál fue utilizado para analizar los niveles de ADAMTs mediante PCR en tiempo real como indicador de estímulo con P4, considerando que ésta proteína es afectada por acción de la P44, y analizar CYP19A1 (característica de las células de la granulosa) y CYP17A1 (característica de la teca), para descartar contaminación cruzada. Los resultados del modelo in vivo evidenciaron expresión de IRβ en el citoplasma de las células de la granulosa y de la teca. La expresión de IRβ en células de la granulosa de folículos preovulatorios del grupo control fue mayor que en los folículos persistentes de todos los grupos (p0,05; Figura 1). Por su parte, la expresión de IGFR1 se observó principalmente en las células de la granulosa y evidenció una expresión similar en folículos preovulatorios del grupo control y persistentes (p>0,05).En el modelo in vitro, se utilizaron los ensayos en los que los folículos seleccionados correspondieron a folículos preovulatorios (relación E2/P4 > 1 en el LF). Para comprobar el estímulo de P4 y poder validar el modelo in vitro se analizó la expresión del gen ADAMT1. Los resultados preliminares evidenciaron que las muestras se encontraron en el límite inferior de la curva estándar con una Tmelting similar a lo observado en la curva estándar, por lo que se continuará con diferentes evaluaciones. Hemos podido demostrar que existen alteraciones de IRβ en estadios iniciales de la persistencia, sin cambios en IGFR1, sin embargo, resta evaluar los niveles de ambos receptores activados. En este sentido, los niveles detectados de estos receptores no serían suficientes para la maduración folicular y posterior ovulación, lo que favorecería a la persistencia folicular y posterior desarrollo de la COD. Por otro lado, logramos obtener cultivos primarios de células de la granulosa puras, que nos permiten simular la persistencia y posteriormente evaluar la posible regulación de ambos receptores.