Evaluación de la expresión de factores de virulencia de Staphylococcus aureus involucrados en la adherencia, invasión y formación de biopelículas en la glándula mamaria bovina

PICECH F; PEREYRA E.A.; RENNA MS; BARAVALLE C; CALVINHO L; DALLARD B; DIEZ C

Córdoba

Jornada; XV Jornadas Argentinas de Microbiología; 2014

Asociación Argentina de Microbiología

Evaluación de la expresión de factores de Staphylococcus aureus asociados a adherencia, internalización y formación de biopelículas en un modelo de invasión a células epiteliales mamarias Picech F, Pereyra EAL, Renna MS, Baravalle C, Calvinho LF, Dallard BE, Diez C El objetivo del trabajo fue evaluar la expresión relativa de genes involucrados en la adherencia, internalización y formación de biopelículas en la glándula mamaria bovina utilizando un modelo de infección in vitro. Se seleccionaron 7 cepas de S. aureus en base a parámetros genéticos, clínicos, epidemiológicos y de susceptibilidad a antibióticos. Las mismas se agruparon en diferentes pulsotipos con un porcentaje de similitud <20% (evaluado por electroforesis de campos pulsantes). Cinco cepas fueron aisladas de infecciones intramamarias (IIM) clínicas y dos de IIM subclínicas (crónicas). En una primera etapa se evaluó la prevalencia de genes involucrados en la adherencia e internalización (ClfA, ClfB, FnbA, FnbB, fib, cna) y formación de biopelículas (IcaA, IcaC, IcaD, bap) a partir de ADN genómico de la totalidad de las cepas por PCR de punto final. Posteriormente, se realizaron ensayos de internalización en una línea de células epiteliales mamarias bovinas (MAC-T) con todos los aislados estudiados y se extrajo ARNm de muestras tomadas en 3 etapas diferentes del ensayo: cultivos bacterianos que no estuvieron en contacto con células del hospedador (grupo control), sobrenadante del co-cultivo de bacterias con células MAC-T (bacterias no internalizadas) y sobrenadante obtenido de la lisis de estas células (bacterias internalizadas). Se cuantificó la expresión relativa de aquellos genes que tuvieron mayor prevalencia en el genoma de los aislados estudiados (ClfA, ClfB, FnbA, FnbB, IcaA, IcaD) por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Finalmente, se evaluó el comportamiento de cada cepa en su capacidad de multiplicación in vitro mediante la construcción de curvas de crecimiento. La mayoría de los genes involucrados en la adherencia e invasión bacteriana y los de proteínas asociadas a formación de biopelícula presentaron expresión relativa significativamente superior en bacterias internalizadas respecto al control (p<0,05), principalmente los genes Fnb e IcaD. La expresión de estos genes estuvo principalmente ligada a cada aislado de S. aureus y no a las características de la IIM (clínica o subclínica). En relación a su capacidad de multiplicación in vitro, los distintos aislados de S. aureus exhibieron diferentes tiempos de duplicación (TD) pero alcanzaron la misma densidad celular máxima (109 UFC/ml) durante la fase estacionaria. Los TD obtenidos no se relacionaron con la capacidad invasiva de la cepa pero sí con la persistencia de la IIM, a juzgar por los TD de los aislados de IIM crónicas, significativamente mayores a los restantes (p<0,05). Se puede concluir que los factores de adherencia celular y formación de biopelícula analizados demostraron estar sobreexpresados en bacterias capaces de invadir células del epitelio mamario bovino, pero sin relación aparente con las características de la IIM producida. Sin embargo, aquellos aislados provenientes de IIM crónicas mostraron una menor velocidad de crecimiento.