Evaluación de la expresión de TLR2 e IL-1alfa en glándula mamaria murina infectada experimentalmente con dos cepas de Staphylococcus aureus de origen bovino con características clínicas y genéticas diferenciales

PEREYRA E.A.L.; DURE A.; PASTOR R.P.; GODOY E; SBOIO O.; CALVINHO L.F.; DALLARD B.E.

ESPERANZA, SANTA FE

Jornada; Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión de la Facultad de Ciencias Veterinarias. UNL; 2015

Facultad de Ciencias Veterinarias. UNL

La mastitis bovina es una de las enfermedades infecciosas más prevalentes del ganado vacuno que genera grandes pérdidas económicas a los productores y la industria láctea mundial. Staphylococcus aureus es el patógeno más frecuentemente aislado de casos de mastitis, tanto en Argentina como en otros países de gran desarrollo lechero. Aunque S. aureus puede causar mastitis aguda y clínica con alteración macroscópica de la leche, la forma más frecuente de presentación es la subclínica con tendencia a la cronicidad, sin alteración macroscópica de la leche, pero con recuentos elevados de células somáticas y persistencia de las bacterias en la glándula mamaria (GM). En la actualidad, el modelo de mastitis causada por S. aureus en ratón continúa siendo una herramienta adecuada para los trabajos de investigación que se centran en la patogénesis y control de las infecciones intramamarias (IIM) en bovinos2.El sistema de defensa de la GM contra los patógenos causantes de mastitis está mediado por factores inmunológicos innatos y adquiridos asociados a este tejido, que actúan en forma coordinada, siendo la eficiencia de estos mecanismos determinante de la resistencia a nuevas infecciones. La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa durante las etapas tempranas de la interacción patógeno-hospedador y se inicia cuando receptores de reconocimiento de patrones (PRR), en la superficie o dentro de las células del hospedador, se unen a moléculas particulares de las bacterias, denominadas patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Los PRR son expresados por los leucocitos de la leche y por las células epiteliales que revisten la GM. Los receptores tipo toll (TLR) forman parte de los PRR, son proteínas estructuralmente relacionadas que reconocen diferentes PAMP e inducen la producción de factores secretados como citoquinas. Dentro de este grupo se encuentra TLR2 que ha sido identificado como el mayor receptor para PAMP de bacterias Gram positivas como peptidoglicanos y ácido lipoteicoico4. El papel de las citoquinas y quimioquinas en la GM se ha estudiado intensamente en los últimos años. A pesar de su rol fundamental en la respuesta del hospedador a la infección, también pueden generar efectos deletéreos sobre el mismo. Por lo tanto, existe un fino balance entre los efectos positivos y negativos de las citoquinas en el hospedador, que está establecido por la maduración, cantidad y ubicación de su expresión. La IL-1α, es una citoquina pro-inflamatoria, producida en grandes cantidades por queratinocitos y en menor medida por macrófagos, tiene efectos específicos quimiotácticos y activadores sobre células fagocíticas, además de otros tipos de células1.El objetivo del trabajo fue evaluar la expresión génica de TLR2 e IL-1α luego de la inoculación intramamaria (IM) experimental de dos cepas de S. aureus de origen bovino con características genéticas, clínicas y epidemiológicas diferenciales en GM de ratón. Por otra parte, se evaluó la localización celular específica de TLR2 por inmunohistoquímica (IHQ)Para las inoculaciones experimentales en los ratones se utilizaron dos cepas de S. aureus de origen bovino que fueron seleccionadas según criterios clínicos y epidemiológicos, utilizando técnicas bacteriológicas tradicionales y técnicas de biología molecular que permitieron diferenciarlas genéticamente. La cepa A, aislada solo una vez durante la lactancia a partir de un animal con IIM clínica (cepa no persistente) y la cepa B de un animal con IIM crónica aislada durante toda la lactancia (cepa persistente). Ambas cepas presentaron patrones clonales diferentes luego de la tipificación por electroforesis en gel de campo pulsantes (PFGE). Se utilizaron ratones hembras preñadas de la cepa BALB/cJ de 6-8 semanas de edad provenientes del Centro de Medicina Comparada (ICIVET-Litoral). Los procedimientos con los animales se realizaron de acuerdo a las normas vigentes (NRC, 2011)3 y el protocolo fue analizado por el comité de Ética y Seguridad de la FCV-UNL. Cinco a siete días después del parto, las madres en lactancia fueron separadas de sus crías y anestesiadas. Se utilizaron 3 grupos de ratones que fueron inoculados en forma IM con las cepas A, B y solución fisiológica-SF (grupo control). Los ratones fueron sacrificados a diferentes tiempos post inoculación (pi): 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216 y 264 hs. Las GM L4 y R4 fueron asépticamente diseccionadas y removidas. Una porción del tejido mamario fue fijada en formol bufferado al 4% para realizar IHQ indirecta utilizando un anticuerpo específico para identificar TLR2. Otra porción fue inmediatamente conservada a -80°C hasta su procesamiento para la realización de RT-PCR en tiempo real para cuantificar la expresión génica de TLR2 e IL-1α.La imunomarcación con anti TLR2 se asoció a estructuras del parénquima mamario principalmente en el citoplasma apical de las células epiteliales que revisten los alvéolos y conductos mamarios. En las GM inoculadas con la cepa A y B de S. aureus se observó marcación intensa durante las primeras 48 hs pi, mientras que en las GM controles la marcación fue débil durante todos los periodos evaluados. La expresión de ARNm para TLR2 se vio influenciada por los tratamientos aplicados (p