Detección del virus de la Diarrea Viral Bovina en muestras de semen de la Cuenca Lechera Santafesina

OCCHI H.; PASSEGI C.; GOLLAN A.; PEREYRA E.A.L.; BECCARIA C.; MOSSO P.; VILLABOAS V

Facultad de Ciencias Veterinarias de Casilda. Universidad Nacional de Rosario

Jornada; Jornadas de Divulgación Técnica Científica 2009; 2009

Facultad de Ciencias Veterinarias de Casilda, Universidad Nacional de Rosario.

El virus de la Diarrea Viral Bovina pertenece a la familia Flaviviridae género Pestivirus y es un ARN (+) que provoca múltiples  manifestaciones clínicas como repetición de servicios, abortos, momificación fetal y defectos congénitos (Baker, 1987; Bolin, 1987). El virus presenta biotipos citopáticos (cp) y no citopáticos (ncp). Cuando las cepas ncp infectan en  período temprano de gestación y el sistema inmune no está completamente maduro se establece una tolerancia con una infección persistente, donde estos animales son seronegativos  y eliminan grandes cantidades de virus por todas sus secreciones y excreciones. Estos animales transmiten por inseminación natural o artificial  la infección ocasionando importantes disminuciones económicas en los rodeos afectados (Bolin, 1987; Afshar,1990). Dadas las características de los animales eliminadores, la serología no tiene preponderancia para su detección. El método clásico es el aislamiento viral, pero tiene las dificultades de mantener el sistema de hospedadores en funcionamiento, efectos tóxicos del semen sobre las células y los tiempos requeridos. Los estudios de DaSilva Nivaldo (1995) demostraron que la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Reversa (RT-PCR) es eficaz para detectar este agente en el semen bovino. El objetivo de este trabajo fue detectar la presencia del virus de la Diarrea Viral Bovina en sémenes que se encuentran en libre comercialización en la cuenca lechera santafesina. Se obtuvieron  38 muestras de sémenes provenientes de distintos centros de inseminación artificial, como así también de tres establecimientos de campo que extraían semen  para su consumo y venta  limitada. Estos fueron debidamente identificados y almacenados  en nitrógeno líquido hasta su procesamiento. Para cada una de las extracciones de ARN de las muestras,  se utilizó 1000ul de Tri-Reagent (Molecular Research Center Inc.) y  150 ul  de semen, se siguieron realizando las extracciones de ARN utilizando cloroformo, isopropanol  y etanol. El pellets resultante se resuspendió en 100ul de  agua libre de RNAsa, se incubó 56oC 10 minutos, se rotularon y  almacenaron a -80 oC hasta la realización de la RT-PCR. RT-PCR: para la primera etapa (RT) se colocaron 1ul de una solución de 500pcmol/ul de Reverse Primer (BVD2)  2ul de Buffer AMV 5X (Promega)   2ul DNTPS por muestra. De la mezcla se coloca 5.5ul en 18ul de cada extracción de semen, se llevó al termociclador por 5 minutos a 650C. Luego se agregaron 1ul de RNasin (12.5U/ul (Promega) y 0.5ul de AMV transcriptasa (Promega) para cada muestra. Se llevó nuevamente el termociclador por 90 minutos a 420C. A 5ul del producto se le agregó 1ul de DNTPS, 5ul de Buffer PCR 10X sin Mg (Promega), 1,5 ul de cloruro de Mg, 1ul de forward primer (BVD 1), 1ul de reverse primer (BVD 2), 1 ul de Taq Polimerasa 1U/ul (Promega) y 34.5 ul de agua libre de RNasa, obteniendo un volumen final de 50ul por muestra. Se llevo al termociclador a 900C dos minutos y luego se realizaron 30 ciclos de: 940C 1 minuto, 500C un minuto y 720C  un minuto. La extensión final se hizo a 72 0C durante 5 minutos. Las secuencias de los primers fueron BVD 1  5´ AAG AAG CTA AAA GCT AAR GGC TAY AA  3´   y BVD 2  5´ TCY TCR TAT AGG CTC CAR TCR TAM TTC ATY TC 3´ ( Integrated DNA  Technologies ). A 10 ul de cada uno de los productos resultantes se le agregaron 2ul de colorante (Azul BO-60-3 Byodinamics). Como marcadores de pesos moleculares se utilizaron 5ul 100 Marqer (Byodinamics ) al que se le agregó 1ul del colorante. Las muestras fueron sembradas en agarosa 2% (Byodinamics DI- LE),  en buffer TBE  (Promega) al que se e incorporó 0.01%  Gel Red Nucleic Acid Cel Satín  (Biotium). Se corrieron una hora a 75 volts en cuba BIO RAD Power PAC, en buffer TBE. Se utilizó como control la cepa Singer y NADL cedidas por el CEVAN. Los resultados obtenidos mostraron que ninguno de los sémenes procesados poseía ARN del Virus de la Diarrea Viral Bovina. Estos resultados  deben ser tomados como preliminares ya que si bien en los 38 sémenes comercializados libremente  y analizados fueron negativos en identificar el virus de la Diarrea Viral Bovina, debe tenerse en cuenta que  la cantidad de muestras estudiadas es escasa,  en relación al número de dosis anuales comercializadas. Se hace necesario pues seguir profundizando estos estudios ya que teniendo en cuenta la población en riesgo, el tema es de alto impacto en los sistemas productivos de la Cuenca Lechera Santafesina