Supervivencia de cepas probióticas encapsuladas destinadas a terneros jóvenes frente condiciones gastrointestinales simuladas.

ZBRUN, M.V.; ASTESANA, D.M.; MARTÍ, L.E.; SIGNORINI, M.L.; SOTO, L.P; OLIVERO, C.R.; SEQUEIRA, G.J.

Esperanza

Jornada; V Jornada de la Difusión de la Investigación y Extensión de la FCV; 2017

Los probióticos son definidos por la organización mundial de la salud como ?microorganismos vivos, que administrados en un adecuado número, confieren beneficios al hospedador?1. Varios factores como el proceso de producción, las condiciones de almacenamiento y las bio-barreras del hospedador, desafían inevitablemente la supervivencia de las bacterias probióticas. Para que ejerzan su efecto beneficioso, los probióticos deben estar presentes a un nivel mínimo (NMS) de 6 o 7 log UFC/g en el alimento a consumir o una ingesta diaria mínima de 8 log UFC2. La utilización de cápsulas de tamaño similar al pellet del alimento balanceado iniciador (macrocápsulas), puede facilitar su administración a los terneros junto con la alimentación3. El objetivo de este estudio fue evaluar la tasa de supervivencia de dos cepas de Lactobacillus encapsuladas en condiciones gastrointestinales simuladas. Las cepas estudiadas fueron L. casei DSPV 318T y L. plantarum DSPV 354T, de origen bovino. Ambas cepas fueron activadas en placas con medio MRS (Man Rogosa Sharpe), a 37ºC por 72 h en anaerobiosis. Luego se realizaron dos cultivos consecutivos, ambas cepas por separado, en caldo MRS a 37ºC durante 16 h. Posteriormente fueron cultivadas, en co-cultivo, en un medio líquido desarrollado en el ?Laboratorio de Análisis de Alimentos del Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral (ICiVet UNL-CONICET)?, el cual contenía: permeado de suero de queso (60 g/l), extracto de levadura 50 (g/l), MgSO4. (0,2 g/l), MnSO4 (0,003 g/l) y tween 80 (1 g/l). Una vez concluido el tiempo de crecimiento del inóculo, el mismo fue neutralizado (pH 6,5) con solución NaOH estéril y posteriormente centrifugado a 4500 g por 15 min. El sedimento obtenido se resuspendió en suero de queso para obtener una suspensión que contenía aproximadamente 11 log UFC/ml. Posteriormente le fue agregada una solución de alginato de sodio y glicerina en proporción 70:30 con respecto al medio de cultivo. La concentración final en la macrocápsula (CAP) para el alginato de sodio fue de 20 g/l y de 75 g/l para la glicerina. Esta mezcla fue depositada en moldes de 1 ml y posteriormente almacenados a -20ºC durante 8 h para solidificar el contenido. Posteriormente, fueron sumergidos, primero en agua hirviendo durante tres segundos, para despegar las CAP del molde y luego en una solución de 0,1M CaCl2 durante 1 h para que el alginato polimerice. Luego, las cápsulas fueron recuperadas por filtración y fueron llevadas a freezer -80ºC por 8 h para su posterior liofilización. La misma se llevó a cabo durante 12 h con una presión de 0,06 mbar y una temperatura de -54ºC. Las CAP fueron conservadas en frezzer -20 ºC hasta su utilización. Para llevar a cabo la digestión in vitro las CAP se incubaron en 9 ml de solución de jugo gástrico simulado (JGS) que tenía 3 g/l de pepsina y pH 2 a 37ºC durante 2 h. Posteriormente, se simuló la solución de jugo intestinal simulado (JIS) para lo cual, el pH de la solución se ajustó a 5,0 (pH similar al del duodeno de los terneros) y se adicionó pancreatina (1 g/l) y sales biliares (1,8 g/l) y se incubó nuevamente a 37ºC por 2 h. Por último, el pH se ajustó a 7,5 (pH similar a la porción distal del intestino delgado de los terneros) y se mantuvieron las concentraciones de sales biliares y de tripsina. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 2 h para un total de 6 h de análisis. Como control, se realizó el mismo tratamiento a bacterias no capsuladas (CNE). Para esto se realizó un cultivo fresco de las dos cepas probióticas en medio de suero de queso. Una vez finalizado el tiempo de incubación las cepas probióticas se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con buffer PBS. Posteriormente se resuspendió en 9 ml de JGS (con una concentración de 109 UFC/ml) y se procedió de la misma manera descripta anteriormente. La viabilidad bacteriana fue evaluada a las 0, 1, 2, 4 y 6 horas de incubación, mediante recuento en placa. Para esto, se realizaron diluciones decimales seriadas en agua peptonada bufferada. A continuación, se sembraron en placas con agar MRS y se incubaron a 37ºC durante 72 h en anaerobiosis. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. La diferencia de viabilidad bacteriana entre las CNE y las CAP se analizó utilizando un ANOVA de medidas repetidas. La pérdida de viabilidad bacteriana a través del tiempo se analizó utilizando un ANOVA de una vía. Se consideró que existía una diferencia significativas cuando P