Purificación de vitelogenina (Vtg) de Caiman latirostris

REY F, STOKER C, RAMOS JG, SIROSKI P, LUQUE EH, BUSSMANN L, MUÑOZ DE TORO MM

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNL. Santa Fe

Congreso; XXIV Congreso argentino de química 2002; 2002

Asociación Química Argentina

La Vtg es una fosfoglicolipoproteína de alto peso molecular sintetizada por el hígado de hembras ovíparas. También la sintetizan machos expuestos a estrógenos constituyéndose en un biomarcador de exposición a xenoestrógenos. Para desarrollar ensayos específicos y sensibles que midan Vtg sérica es necesario obtenerla altamente purificada para generar anticuerpos o usarla como standard. Palmer y col. (1995) describieron el aislamiento por precipitación con EDTA-Mg de Vtg de tortuga obteniendo cantidades y pureza adecuadas para generar un anticuerpo policlonal. Nuestro objetivo fue: 1) inducir altos niveles de Vtg en yacaré y tortuga, 2) purificar Vtg de yacaré, 3) comparar la eficiencia del método en ambas especies. Hembras juveniles de yacaré (~1,3 kg) se inyectaron diariamente durante 7 días con 17b-estradiol (E2) (1mg/g de peso). Se tomó sangre, al inicio del tratamiento y el día 10, en tubos heparinizados y con aprotinina (0,0175 TIU/ml de sangre). Tortugas macho juveniles (Phrynops hylarii) (~0,8 kg) recibieron dos dosis de E2 (1mg/g de peso) con 7 días de diferencia, se obtuvo plasma al inicio del tratamiento y el día 14. Se realizó una 1º precipitación con EDTA-Na2 20 mM pH 7,7 y MgCl2 0,5M. El ppdo se resuspendió en buffer A (NaCl 1M, 50mM Tris-HCl pH 7,7) y se volvió a precipitar por disminución de la fuerza iónica con H2Od. Este 2º ppdo se resuspende en buffer A. Para comparar la eficiencia del método de purifición de Vtg en ambas especies todas las fracciones obtenidas (ppdos resuspendidos y sobrenadantes) fueron analizadas por PAGE-SDS en gradiente (7-12%). Los geles se tiñeron con Coomassie blue y Stains All (identificación de proteínas fosforiladas). Los geles teñidos con Coomassie blue fueron scaneados en 300 dpi (ScanJet ADF, Hewlett Packardâ) y la densidad óptica integrada (DOI) de las bandas de Vtg fue evaluada con analizador de imágenes (Imag-Pro Plusâ 3.0). El producto final de la precipitación del plasma de yacaré fue sometido a cromatografía de intercambio iónico (Cromatógrafo Äkta Prime, columna Hi-Trap 5ml QXL, Amersham Pharmacia) eluyente: gradiente lineal 0 a 1M NaCl en TRIS 25mM, detector simultáneo de absorbancia a 280nm y conductividad (mS/cm). Los criterios de identificación para caracterizar la Vtg fueron: ausencia en el suero de machos no tratados, inducción por E2, PM de la forma nativa ≈ 440 kDa y fosforilación. El análisis cualitativo de los PAGE-SDS muestra que la técnica de precipitación es más efectiva para Vtg de tortuga que de yacaré. Se recuperó una cantidad importante de Vtg en el 1º ppdo de tortuga. En el yacaré, si bien el 1º ppdo enriquece la fracción de Vtg se observa contaminación con otras proteínas plasmáticas, además, hay una banda importante de Vtg en el 1º sobrenadante. La 2º precipitación tuvo baja efectividad en ambas especies observándose la banda característica de Vtg en las 3 fases aisladas (ppdo, sobrenadante acuoso y capa lipídica). El Stains All confirmó la naturaleza fosforilada de las bandas de Vtg. La cromatografía por intercambio iónico purificó el precipitado del plasma de yacaré, obteniéndose un pico que se eluye en 0.6M NaCl. Esto permitiría obtener Vtg en cantidad y pureza suficientes. El desarrollo de un ELISA para Vtg de yacaré permitirá monitorear niveles plasmáticos de Vtg asociados con áreas de diferente exposición a xenoestrógenos