OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS DE DOMINIO ÚNICO DERIVADOS DE CAMÉLIDOS (VHH O NANOANTICUERPOS), ESPECÍFICOS CONTRA IgG MURINA PARA DESARROLLO DE UN NUEVO MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

MARCHESE F; BOZZO J; LOPEZ N; GRIPPO V

Jornada; IX JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES-FVET-UBA; 2019

Facultad de Ciencias Veterinarias-UBA

La industria de anticuerpos monoclonales convencionales (mAcs) ha tenido un desarrollo sostenido en los últimos 30 años, debido a su aplicación tanto en diagnóstico, terapia e investigación. El método más utilizado para la obtención de mAcs altamente puros es la cromatografía de afinidad mediada por proteína A (ProtA). No obstante, el método presenta ciertas desventajas, tales como el requerimiento de elución en condiciones ácidas y un costo elevado. Por otro lado, los Acs de dominio único derivados de camélidos (llamados VHH onanoanticuerpos) presentan ciertas características como ser su tamaño pequeño, alta solubilidad y estabilidad fisicoquímica, que han determinado un crecimiento exponencial de sus aplicaciones biotecnológicas, incluyendo su uso como ligando para la purificación de proteínas por cromatografía de afinidad. Por esta razón, nuestro objetivo fue obtenernanoanticuerpos (nanoAcs) específicos contra IgG murina (IgGm) para ser utilizados como ligando en una nueva resina de purificación de mAcs por cromatografía de afinidad. Para llevar a cabo esto, dos llamas (Lama glama) fueron inmunizadas con IgGm, obteniéndose una alta respuesta humoral al final del esquema de inmunización en ambos animales medida por ELISA. A partir de la sangre periférica de las llamas, se aisló el ARN total y se obtuvo el ADN copia por RT-PCR. Luego, se realizó una primera PCR para amplificar las regiones variables de las cadenas pesadas tanto de Acs convencionales (producto de 900bp) como de Acs de solo cadena pesada (producto de 700bp). En una segunda PCR, se amplificó el fragmento VHH (producto de 400 pb) y se clonó en el vector fagémido pHEN4. Las construcciones obtenidas fueron electroporadas en bacteria (E. coli cepa TG1) generando dos bibliotecas inmunes de nanoAcs. Ambas bibliotecas presentaron un tamaño mayor al mínimo aceptado (>107 UFC/μg ADN) y un 100% de clones con inserto completo determinado por ?colony-PCR?. Posteriormente, se realizaron dos rondas de selección de nanoAcs contra IgGm por la metodología de Phage Display. La diversidad de los 24 nanoAcs seleccionados más reactivos fue analizada por digestión con una enzima de restricción de corte frecuente. Los 4 nanoAcs con mayor reactividad fueron expresados como proteínas solubles en bacteria y su reactividad específica confirmada en ELISA y Western Blot. En conclusión, se construyeron dos bibliotecas inmunes de VHH y se logró seleccionar nanoAcs específicos contra IgGm. Estos VHH serán utilizados como ligando de afinidad en el desarrollo de un nuevo método de purificación de Acs monoclonales convencionales.