CONSTRUCCION DE BIBLIOTECAS DE NANOANTICUERPOS PARA LA OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS CONTRA LA CEPA O1/CAMPOS DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA

DE NICOLA J; BOZZO J; MATTION N; GRIPPO V

CABA

Jornada; V JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES Ciencia y Sociedad; 2015

Facultad de Ciencias Veterinarias-UBA

CONSTRUCCION DE BIBLIOTECAS DE NANOANTICUERPOS PARA LA OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS CONTRA LA CEPA O1/CAMPOS DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSAIntroducción. La Fiebre Aftosa es considerada económicamente la enfermedad infecciosa más importante que afecta a especies de interés pecuario. Los Nano-anticuerpos o VHHs se caracterizan por su alta especificidad, estabilidad, afinidad por el blanco, y un reducido tamaño (15kDa) que permite fijar mayor densidad de anticuerpos, incrementando la sensibilidad diagnóstica.Objetivo. El objetivo fue inducir una elevada respuesta inmune contra el VFA en llamas para construir bibliotecas de Nano-anticuerpos que permitan la obtención de anticuerpos específicos contra la cepa O1/Campos del VFA.Materiales y Métodos. Se inmunizaron dos llamas (Lama glama) con la cepa O1/Campos del VFA, 3 veces cada 15 días. A partir de linfocitos de sangre total periférica, se aisló el ARN total y se obtuvo ADN copia por RT-PCR. En una primera PCR, se amplificaron las regiones variables de cadenas pesadas tanto de anticuerpos convencionales (producto de 900bp) como de anticuerpos de cadena única (producto de 700bp). En una segunda PCR, se amplificó solo el repertorio de VHH (400bp) y estos fragmentos fueron clonados en el vector pHEN4 y tales construcciones se electroporaron en la cepa E. coli TG1 obteniéndose 2 bibliotecas de Nano-anticuerpos cuya calidad fue comprobada por colony-PCR y subsecuente digestión con la enzima de restricción HinfI.Resultados. Se comprobó la inducción de una alta respuesta inmune contra la cepa O1/Campos en las llamas inmunizadas por ELISA en fase líquida. El título fue menor a 1.10 para el suero pre-inmune y alcanzó después de las inmunizaciones un valor de 4.95 y 3.80 para la llama 1 y 2, respectivamente. Mediante dos PCR consecutivas se obtuvo el fragmento VHH del tamaño esperado (400bp) y se clonó en el vector fagémido pHEN4. Se generaron 2 bibliotecas inmunes de Nano-anticuerpos cuyo tamaño fue mayor al aceptado (>107 UFC/μg ADN) y con un alto porcentaje de clones con inserto completo (94,4% y 100%, respectivamente) determinado por colony-PCR. Por último, la alta variabilidad de los anticuerpos fue corroborada por digestión enzimática para proceder a la selección de anticuerpos específicos por Phage display.Conclusiones. Se obtuvieron las dos primeras bibliotecas inmunes de VHH en el Instituto para la obtención de Nanoanticuerpos específicos contra la cepa O1/Campos del Virus de la Fiebre Aftosa, con potencial aplicación en el desarrollo y la innovación del diagnóstico de esta infección.