PERSONAL DE APOYO
REINER Gabriela De Las Nieves
congresos y reuniones científicas
Título:
EVALUACION DE LA CITOTOXICIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS CON ACTIVIDAD GABAÉRGICA.
Autor/es:
LETICIA E. DELGADO-MARÍN; GABRIELA N. REINER; ENEIDA DE PAULA; DANIEL A. GARCÍA
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; XXIX Congreso Argentino de Química; 2012
Institución organizadora:
Asociación Química Argentina
Resumen:
Introducción
El receptor GABAA es el principal receptor inhibitorio del sistema nervioso
central. Posee diferentes lugares de reconocimiento para la unión de ligandos
específicos y moduladores. Estos compuestos son potencialmente útiles en medicina
humana como agentes analgésicos, anestésicos, ansiolíticos y anticonvulsivantes. Los
moduladores más conocidos son benzodiazepinas, barbitúricos y neuroesteroides
entre otros. Cada uno de estos compuestos se comporta como modulador alostérico
de los demás potenciando, en general, su unión al receptor [1]. Recientemente,
nuestro grupo de trabajo ha descripto a diferentes compuestos fenólicos derivados del
propofol, un reconocido agente gabaérgico, como modulares positivos de dicho
receptor [2,3,4,5]. En el presente trabajo, se evalúa la citotoxicidad de estos
compuestos, incluyendo a propofol como referencia, a concentraciones similares a las
que demostraron efectos farmacológicos.
Metodología
Se incluyeron en el presente trabajo cinco compuestos fenólicos: eugenol,
timol, propofol y carvacrol y clorotimol. Propofol es un compuesto de síntesis,
clorotimol es un monoterpenoide derivado de timol y los demás son componentes
importantes de numerosos aceites esenciales. Timol y carvacrol son extraídos de
aceites esenciales de numerosas especies de tomillo (género Thymus) y de orégano
(gen. Origanum) respectivamente, mientras eugenol se encuentra en numerosas
especies como la albahaca y el clavo de olor (gen. Ocimum y Syzygium) [6,7].
Se realizaron cultivos primarios de neuronas corticales de embriones de rata
(16-18 días de gestación) y se determinaron sus efectos sobre la viabilidad celular a
través de la evaluación de la integridad mitocondrial de la célula (reducción de MTT) y
de la integridad de la membrana celular (liberación de Lactato Deshidrogenasa LDH).
Los cultivos y ambas técnicas nombradas se realizaron según lo indicado en García et
al., (2006) [3]. Brevemente, se disecan las cortezas cerebrales de embriones de ratas
de 16-18 días de gestación y tras la digestión con tripsina, se centrifuga y aspira el
sobrenadante para luego proceder a la digestión mecánica. Las células obtenidas se
resuspenden en medio de cultivo apropiado. Los ensayos se realizan entre los 6-7
días in vitro, cuando estas células expresan el receptor GABAA funcional.
Para valorar la toxicidad de los compuestos se analizó paralelamente su
capacidad de inducir hemólisis en condiciones isotónicas, siguiendo la técnica
descripta por Malheiros et al. [8]. La sangre fue suministrada por el banco de sangre
del Hemocentro de Campinas. Los eritrocitos fueron obtenidos y diluidos en PBS, pH
7.4, hasta una absorbancia aproximada de 0,9 a 412 nm (hematocrito del 0,15%).
Luego, se prepararon las muestras con los correspondientes compuestos fenólicos y
se dejó incubar durante 15 minutos a 37°C. Finalmente, después de una centrifugación
a 1500 g por 10 min, se midió la concentración de hemoglobina liberada al
sobrenadante para calcular el porcentaje de hemólisis (% H) como se describe a
continuación:
% H = [(AS - APBS) / (AH2O - APBS)] * 100
donde AS , APBS y AH2O corresponden a las absorbancias a 412 nm de la solución de
eritrocitos en presencia del compuesto (muestra), resuspendidos en buffer (control) o
resuspendidos en agua (100% hemólisis), respectivamente.
Resultados
El análisis de los resultados de los ensayos de citotoxicidad, realizados en
neuronas corticales, mostró que ninguno de los compuestos ensayados disminuyó
significativamente la viabilidad celular a concentraciones donde los mismos
demostraron tener actividad sobre el receptor GABAA. Esto implica que la presencia de
los compuestos fenólicos ensayados, al menos hasta 24 hs posteriores a su
incorporación al medio de cultivo, no alterarían la integridad mitocondrial y de la
membrana plasmática de las neuronas a concentraciones farmacológicamente activas.
Sin embargo, en caso del clorotimol, si bien no demostró un claro efecto sobre la
viabilidad neuronal según los ensayos realizados, las células mostraron signos
morfológicos de daño a concentraciones mayores a 100 μM.
Los resultados de hemólisis mostraron que ninguno de los productos
ensayados indujo la rotura de los eritrocitos como consecuencia de su actividad sobre
la membrana de los mismos ya que los porcentajes de hemólisis no fueron
significativamente diferentes a la muestra control (eritrocitos en ausencia de los
compuestos).
Conclusiones
Los datos obtenidos de los ensayos realizados sugieren la ausencia de
citotoxicidad de los compuestos fenólicos estudiados al menos hasta 24 hs de
exposición a los mismos y a concentraciones similares a las farmacológicamente
activas sobre el receptor GABAA. A pesar de su alta lipofilicidad y tendencia a
particionarse en fases membranosas [9] ningún compuesto mostró capacidad
hemolítica.