Efecto del empaquetamiento molecular sobre la actividad de beta-galactosidasa transferida a filmes tipo Langmuir-Blodgett conteniendo dipalmitoilfosfatidilcolina

EDUARDO M. CLOP; JULIETA M. SÁNCHEZ; MARÍA A. PERILLO

Biblioteca Nacional. Bs. As. Argentina

Otro; XXI Reunion Anual de la SAB; 2002

SAB

En trabajos previos demostramos que la interacción de la hidrolasa b-galactosidasa de Kluyveromyces lactis (creo qu es E. coli)(b-Gal) con bicapas induce una modulación diferencial en la actividad de la enzima sobre sustratos solubles, dependiendo de la composición, de la curvatura y del empaquetamiento de la membrana, y en consecuencia, del tipo de interacción lípido-proteína que pueda establecerse (penetración o adsorción) (Coll.Surf., 2002, 24:21-31). También demostramos que, más allá de la estructura química particular, la topología afecta la dirección de los efectos  ejercidos por sustancias moduladoras que formen parte de una interfase (Biophys.Chem, en prensa). Además, vimos que en estos sistemas heterogéneos,  los equilibrios de partición y las barreras de difusión contribuirían, conjuntamente con cambios en el mecanismo intrínseco de la reacción, a la modulación de la cinética de hidrólisis del sustrato (Satellite Symposium ISN 2001,  Iguazú, Misiones). El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto sobre la actividad enzimática que induce la restricción en la movilidad de la b-Gal por incorporación a un espacio bidimensional, en condiciones de empaquetamiento controlado. A tal fin se realizaron los siguientes experimentos. Se puso a punto la técnica de transferencia capas monomoleculares de dipalmitoyl fosfatidil colina (dpPC) en la interfase agua-aire (área total 2.1x104mm2) (conteniendo o no albúmina o b-Gal) a un soporte sólido hidrofóbico (vidrio silanizado de 508 mm2). Por la técnica de Langmuir-Blodgett, a una velocidad de inmersión de 3mm/min; se lograron transferir hasta dos capas por vidrio con un rendimiento de 4-20 vidrios de similar calidad por cada monocapa, con un % de recubrimiento para cada capa el cual, dependiendo de la composición y de la presión lateral de la monocapa, osciló entre un 50 y un 130%. A medida que aumentó la presión lateral inicial de dpPC, aumentaron el % de recubrimiento, el número total de vidrios recubiertos por monocapa (me parece que disminuye) y la similitud entre la 1º y la 2º capa. La proteína se inyectó en la subfase a una concentración de 15-45 mg/ml (albúmina) o 37mg/ml (b-Gal) y se permitió que penetrara en la monocapa (pcut-off albúmina= 22 mN/m; pcut-off b-Gal= 37mN/m). La pinicial aumentó con el sembrado de la proteina subfase en función del tiempo y cuando se alcanzó el plateau en la p (aproximadamente 28 y 41 mN/m para albúmina y b-Gal respectivamente) se comenzó la transferencia de la monocapa al soporte sólido. La cantidad de proteína transferida (7-9mg albúmina/mm2) disminuyó en función de la pinicial. La actividad específica de b-Gal en solución acuosa y la de la enzima transferida a soportes sólidos a partir de monocapas a pinicial 0, 15 y 35 mN/m fue 20, 0.042, 0.26 y 0.0106 mmol ONP/min/mg proteína. Estos resultados indican que, al ser transferida  a la monocapa, la enzima disminuye su actividad, respecto a la proteína en solución. Además, el empaquetamiento molecular modula la hidrólisis de un sustrato soluble catalizada por la enzima incorporada a la interfase, observándose picos de actividad a presiones intermedias,  de forma similar a lo observado el caso de enzimas solubles (PLA2, PLC, Neuraminidasa) cuya actividad es modulada por la organización superficial del sustrato.