Bioactividad de beta galactosidasa en un ambiente que simula la superpoblación molecular de los alimentos y del quimo.

NOLAN, V, SANCHEZ, JM Y PERILLO, MA.

Cordoba

Congreso; III Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos.; 2009

Ministerio de Ciencia y Tecnica de la Provincia de Cordoba

En nuestro laboratorio se está desarrollando una formulación oral conteniendo la enzima ß-galactosidasa (ß-Gal) para ser aplicada, usando alimentos como vehículo, en la terapia de sustitución enzimática para el tratamiento de la hipolactasia. Esto requiere identificar las bases físico-químicas potenciales que explican el efecto de los sistemas biológicos que constituyen alimentos sobre la biodisponibilidad y la actividad del fármaco (la enzima, en este caso). La mayoría de las formulaciones alimenticias y también el quimo (la masa de alimentos digeridos que se transporta a lo largo del aparato digestivo) son sistemas molecularmente muy concentrados. Debido a esta superpoblación molecular: a)  la actividad termodinámica del agua es notablemente baja respecto a la del agua libre, pudiendo afectar el efecto hidrofóbico que participa en el plegamiento de las proteínas y b)  aparecen efectos de volumen excluido que pueden afectar la velocidad de difusión de solutos y, en consecuencia, la cinética de las reacciones químicas. Las disoluciones de polímeros hidrofílicos de alto peso molecular tales como el polietilenglicol (PEG), constituyen un modelo para estudiar este tipo de ambientes. El objetivo del presente trabajo fue evaluar si la superpoblación molecular inducida por PEG-6000 modula la actividad enzimática y la estabilidad conformacional de la ß-Gal de Escherichia coli. Se evaluó la variación de la velocidad de hidrólisis de un sustrato artificial (orto-nitrofenilgalactopiranósido, ONPG) a concentraciones 0-3 mM ONPG, en presencia de PEG-6000 (entre 0 y 25 % P/V). Las muestras se incubaron a 37 ºC durante 15 min.. La reacción se detuvo por medio del agregado de NaOH 0,1 M (concentración final) y una incubación a 100 ºC durante 10 min. El sólo cambio de pH no fue suficiente para inactivar la enzima. Por otra parte, el Na2CO3, usado tradicionalmente como inactivador en este tipo de ensayos, fue reemplazado por NaOH para prevenir la separación de fases liquído-líquido inducida por PEG. La reacción mostró una cinética michaeliana a todas las concentraciones de PEG. Los parámetros cinéticos (KM y Vmax) aumentaron en función de la [PEG], pasando de KM=0,27 mM y Vmax= 0,0151 µmol/min./mg.proteína en ausencia de PEG a KM=0,55mM y Vmax= 0,0180        µmol/min./mg.proteína a [PEG]=25 % P/V. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la proteína en agua mostró un equilibrio de desplegamiento con dos dominios calorimétricos (Tm1=46,4 °C, Tm2=53,4 °C). El aumento en la concentración de PEG, desplazó +1 ºC a Tm1, con disminución del DH1 hasta desaparecer a [PEG]=35 %P/V. El segundo pico, apareció a Tm2=cte hasta [PEG]=35 %  P/V donde se observa un DT=+0,8oC respecto al control. En presencia de PEG aparece un tercer pico, ausente en el control, que pasó de Tm3=56,36 oC a PEG 25 %P/V a Tm3=57,18  oC a [PEG]=35  % P/V. La disminución en la hidratación del entorno molecular de ß-Gal induciría un cambio en la estructura que se traduciría en efectos sobre la cinética de la reacción.