INVESTIGADORES
FERNANDEZ LARROSA Pablo Nicolas
congresos y reuniones científicas
Título:
DISEÑO DE UNA TÉCNICA DE LABORATORIO PARA DETECTAR FORMAS CIRCULARES DE DNA PROVIRAL CON 2- LTR DE HIV.
Autor/es:
A. MUSTO; D. CHOUHY; G. ANDREANI; P. N. FERNÁNDEZ LARROSA; R.D. RABINOVICH; A. GIRI; L. A. MARTÍNEZ PERALTA
Lugar:
La Plata, Argentina
Reunión:
Congreso; 7° Congreso Argentino de SIDA; 2005
Resumen:
Objetivo: Durante la infección por HIV una vez que ingresa el
virus a la célula se retrotranscribe el ARN viral de simple cadena
a ADN de doble cadena el cual es transportado al núcleo donde
la mayor parte se integra al ADN celular y otra parte se circulariza
para formar episomas con 1-LTR o 2-LTR. Estas estructuras son
considerados productos lábiles por lo que la presencia de ellos a
nivel nuclear indicaría infección activa. Existen evidencias acerca
de que cuando se trata de células como macrófagos, contrariamente,
resultan ser estables. El objetivo de este trabajo consiste
en diseñar una técnica sencilla de laboratorio para realizar la detección
del ADN con 2-LTR como estimador del ADN no integrado.
Materiales y Métodos: Se diseñaron cebadores sentido y antisentido
conjugado este último en su extremo 5´ a biotina. Seguido a
esto se realizó una desnaturalización e hibridación en fase líquida
del producto de PCR biotinilado con una sonda específica conjugada
con fluoresceína. Luego se procedió a la inmovilización de los
híbridos en la microplaca sensibilizada con estreptavidina. Finalmente
se detectaron los híbridos con el agregado de un anticuerpo
antifluoresceina conjugado con peroxidasa, se agregó un sustrato
cromogénico y se realizó la lectura espectrofotométrica a 450nm.
Las muestras utilizadas para la detección de ADN no integrado
provenían de células H9 en infección activa a distintas concentraciones.
La purificación del ADN se llevó a cabo en estas muestras
utilizando columnas de Qiagen. Como control positivo se utilizó
una construcción con un plásmido con el fragmento de interés
amplificado.
Resultados: todas las muestras estudiadas resultaron positivas
por esta técnica.
Conclusiones: La forma de ADN extracromosómico con 2-LTR es
la única que se puede discriminar de las otras formas de ADN del
HIV porque posee dos regiones con LTR. Se pudo poner a punto
la PCR seguida de la detección colorimétrica, resultando todas las
muestras estudiadas positivas, ya que se trata de células H9 en
infección activa.