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Desarrollo de una prueba de ELISA para detectar anticuerpos en carneros vacunados y/o desafiados con Corynebacterium pseudotuberculosis F.A. Paolicchi1,5, J.J. Solanet2, R. Malena1, S.M. Estein3, S. Estevao Belchior4. 1Laboratorio de Bacteriología, EEA INTA Balcarce; 2Residencia Interna en Salud Animal, INTA Balcarce; 3Laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA; 4Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Naturales, UNP San Juan Bosco; 5Facultad de Ciencias Agrarias, UNMdP, Balcarce, Argentina. e-mail: fpaolicchi@balcarce.inta.gov.ar INTRODUCCIÓN: La Linfoadenitis Caseosa (LC) o pseudotuberculosis ovina es una enfermedad infectocontagiosa bacteriana ocasionada por Corynebacterium pseudotuberculosis que produce lesiones caseosas-purulentas principalmente en los linfonódulos y en el pulmón. Afecta a ovinos y caprinos, aunque tambien a otras especies animales y al humano. La LC provoca pérdidas en la industria ovina mundial, como reducción en la ganancia de peso, disminución de la eficiencia reproductiva, en la producción de leche y lana, decomiso de las canales impactando en las exportaciones y el valor de las reses. En Argentina se estima una prevalencia del 70% en áreas endémicas. La transmisión de LC se produce a través de las heridas provocadas durante la esquila con cuchillas contaminadas con el material purulento de los abscesos o con otros materiales contaminados. La identificación de los animales infectados es relevante para asumir un programa de control en las majadas. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un ELISA indirecto para medir respuesta inmune humoral en carneros vacunados y/o infectados con C.pseudotuberculosis. Para ello se desarrolló un modelo experimental de infección para estudiar la cinética de anticuerpos generada por el desafío o por la aplicación de una bacterina. MATERIALES Y MÉTODOS: Corderos de 4 meses de edad, clínicamente sanos, provenientes de un establecimiento libre de LC, fueron distribuidos en 4 grupos: Grupo 1 vacunado (G1, n=5), Grupo 2 vacunado/inoculado (G2, n=8), Grupo 3 inoculado (G3, n=2), Grupo 4 control (G4, n=2). Los animales de los grupos G1 y G2 fueron inmunizados a fin de obtener títulos serológicos desarrollados posvacunación, para lo cual se aplicaron dos dosis de 3 mL. de una bacterina no comercial con un intervalo de 4 semanas. La bacterina compuesta de C. pseudotuberculosis inactivada con 0,5% de formol bufferado pH 7,2 y formulada en OHAl, contenía antígeno somático en una concentración de 10 mg/ml de la cepa. Cuatro semanas post-vacunación, los animales de G2 y G3 fueron desafiados con una cepa indígena sometida a secuenciación del gen 16S rDNA, demostro un 99% de homología con secuencias alineadas de C.pseudotuberculosis CIP102968T y C.pseudotuberculosis NCTC 3450 del Gen Bank. La misma fue reactivada por pasaje en carnero y reaislada para el desafio. El inóculo tuvo una concentración de 7,75x108 UFC/mL. y fue aplicado en la zona interdigital de la pata derecha. Los animales fueron revisados cada 15 días, inspeccionando linfonódulos y sitio de inoculación, para comprobar lesiones clínicas de LC. Para la determinación de anticuerpos en el G1 se realizaron sangrías cada 15 días desde el comienzo del ensayo hasta los 45 días pos vacunación, mientras que en los grupos G2, G3 y G4 se realizaron muestreos adicionales a los 90 días y en 4 oportunidades más hasta los 200 días donde finalizó el ensayo. Se realizó la necropsia de los animales del G2, G3 y G4 a las 28 semanas de iniciado el ensayo. Los animales del G1 fueron faenados 6 meses después e inspeccionadas sus carcasas y órganos para verificar posibles lesiones. Las muestras seleccionadas de G2, G3 y G4 fueron linfonódulos poplíteo, prefemoral, preescapular, pulmón, sitio de inoculación y abscesos, las que se cultivaron en Agar Sangre Columbia a 37 ºC, 10% de CO2, por 48-72 h. Se observó la morfología colonial y las colonias típicas con β- hemólisis se seleccionaron y sometieron a: tinción de Gram, pruebas bioquímicas y pruebas de hemólisis sinérgica a Rhodococcus equi (CAMP) y de inhibición de la beta hemolisina del Staphilococcus aureus para detectar la producción de fosfolipasa D (CAMP reversa) y diferenciar a C. peudotuberculosis de otras Corinebacterias. Para los estudios patológicos, muestras de pulmón y linfonódulos se fijaron en formol al 10%, se seccionaron y tiñeron con hematoxilina y eosina según técnicas de rutina. Para el ELISA el antígeno empleado fue elaborado con la cepa reactivada cultivada en caldo tripticasa soya y obtenido un pellet se resuspendió, disgregó por sonicación y determino su concentración proteica (BCA? Protein Assay). Se adsorbieron placas de 96 pocillos con 100 µl del antígeno por pocillo (4 µg/mL.) y se incubaron por la noche a 4 ºC. Se añadió por duplicado a cada pocillo 100 µl del suero diluido 1:200 utilizando sueros controles positivos de animales con lesiones y cultivo positivo y controles negativos de carneros sanos negativos a LC por cultivo. Se utilizo Proteina-G-peroxidasa 1:3000 y revelo la reaccion con ABTS/H2O2 30% con tampón citrato. La lectura se realizó con filtro 405 nm y programa ELISA 2.20. Los resultados fueron obtenidos en densidad óptica (DO) y expresados en Porcentaje de Positividad (%PP). Para calcular la exactitud del ELISA se analizó la Sensibilidad y Especificidad mediante el método de la curva ROC utilizando el programa MedCalc, Versión 4.1. El cálculo de la Se y Es se obtuvo con sueros positivos y negativos de: 1) grupo positivo verdadero: 1.a) sueros de ovinos desafiados y enfermos de LC con aislamiento positivo y, 1.b) sueros de 48 ovinos con LC y aislamiento positivo provenientes de frigorífico de un área endémica del país, y 2) grupo negativo verdadero: 2.a) sueros de ovinos jóvenes y adultos clínicamente libres de LC provenientes de campos libres de LC y, 2.b) sueros de 244 ovinos sanos sin aislamiento de C. pseudotuberculosis provenientes de áreas libres de LC. RESULTADOS: La cepa inoculada en los animales de G2 y G3 reprodujo las lesiones macroscópicas y microscópicas típicas de LC y la misma fue aislada del sitio de inoculación, linfonódulos y/o pulmón en 7/8 animales del G2, en 2/2 animales del G3. La prueba de ELISA detectó en los sueros diferencias significativas entre animales seroreactores de los diferentes grupos experimentales y permitió establecer una relación con el tipo de tratamiento aplicado. El area bajo la curva ROC del ELISA resultó en un valor de 0,999 (Error standard 0,004) indicando una Se de 98% y una Es de 100% y el punto de corte seleccionado fue de un PP ≥17.6% que discrimino entre sueros ovinos positivos y negativos. CONCLUSIONES: Se concluye que el ELISA desarrollado puede ser una herramienta útil para identificar animales infectados y con clínica positiva a LC. Los resultados son promisorios para su uso a nivel de majadas en programas de erradicación de la enfermedad. Es probable que el antígeno crudo utilizado en este ELISA descrito tuviera un porcentaje no conocido de exotoxina contribuyendo de esta forma a maximizar los resultados obtenidos con sueros de animales desafiados con C. pseudotuberculosis. Este modelo experimental de LC, el primero desarrollado en nuestro país, demostró ser muy útil para medir respuesta inmune y comprobar la patogenicidad de cepas indígenas y estudiar la inmunopatogenia de C.pseudotuberculosis en ovinos. Otros estudios utilizando pruebas que evalúen inmunidad celular podrían contribuir a completar los estudios de diagnóstico, virulencia e inmunopatogenicidad de la LC en ovinos. BIBLIOGRAFIA 1. Dercksen D, Brinkhof J, Dekker-Nooren T, et al. 2000. A comparison of four serological tests for the diagnosis of caseous lymphadenitis in sheep and goats. Vet.Microbiol,167-175. 2. Dorella F, Pacheco L, Olivera S, et al. 2006. Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties, pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet.Res., 37:201-18. 3. Seyffert N, Guimarães A, Pacheco L, et al. 2010. High seroprevalence of caseous lymphadenitis in Brazilian goat herds revealed by Corynebacterium pseudotuberculosis secreted proteins-based ELISA. Res Vet Sci, 50-55.

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