INVESTIGADORES
CASTAGNARO Atilio Pedro
congresos y reuniones científicas
Título:
OPTIMIZACIÓN DE LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE LA CAÑA DE AZÚCAR Y OBTENCIÓNDE GENOTIPOS TOLERANTES A HERBICIDAS EN LA ESTACIÓN EXPERIMENTAL AGROINDUSTRIAL OBISPO COLOMBRES (EEAOC).
Autor/es:
NOGUERA, ALDO SERGIO; RACEDO, JOSEFINA; FILIPPONE, MARÍA PAULA Y CASTAGNARO, ATILIO PEDRO.
Lugar:
San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina.
Reunión:
Congreso; XV Reunión Técnica Nacional de la Caña de Azúcar; 2008
Resumen:
Las plantas cultivadas han sido manipuladas genéticamente por el hombre desde hace siglos a
través de ciclos de cruzamiento y selección, lo que se conoce como mejoramiento convencional (o
clásico). Este es un proceso lento y laborioso que puede tardar entre 5 y 11 años, según el cultivo, y
para el cual es indispensable contar con variabilidad genética seleccionable. Uno de los principales
problemas de esta aproximación es que cuando se persigue un carácter, aunque éste esté controlado
por uno o pocos genes, en cada ciclo nunca se selecciona a un solo gen sino a un grupo entre los
cuales puede haber genes indeseables. Sumado a esto, en algunos casos, las características de interés
no se encuentran en el germoplasma cultivado ni en el directamente emparentado lo que imposibilita su
transferencia por vía sexual. El reciente desarrollo de métodos no sexuales para transferir genes, como
la transformación genética directa, permite superar estas limitaciones convirtiéndose en una
herramienta valiosa para la mejora vegetal. Sin embargo, esta tecnología solo sirve para transferir una o
pocas características a una variedad ya mejorada. Existen distintos métodos para transformar plantas
cuya elección depende de la especie, del material vegetal, de la capacidad de regeneración y de la
eficiencia de transformación. La técnica de biobalística (Sanford, J.C. et al (1987). Particle Sci. Tech.
5:2737 .) ha sido empleada con muy buenos resultados en una gran variedad de especies vegetales
incluída la caña de azúcar. Dicho método involucra un proceso en el cual micropartículas recubiertas
con DNA son aceleradas por un gas comprimido e introducidas en células vegetales de un tejido
indiferenciado llamado callo. La Sección Biotecnología de la EEAOC trabaja desde el año 2006 en la
transformación genética de caña de azúcar con la finalidad de introducir genes de interés agronómico
en las variedades comerciales locales RA 87-3 y TUC 77-42. A fin de evaluar la eficiencia de la técnica
de biobalística, se realizaron ensayos de expresión de un gen reportero (uidA) que permite detectar
visualmente la incorporación del mismo en el genoma de las células vegetales. Esto permitió ajustar los
parámetros involucrados y optimizar el proceso de transformación de tejido calloso con el gen de
interés, como así también optimizar la regeneración de plantas a partir de callos embriogénicos. Para la
obtención de los callos embriogénicos utilizados como explantes, se cultivaron in vitro discos de ápice
caulinar de caña de azúcar. Una vez obtenidos, los callos fueron bombardeados con partículas de
tungsteno recubiertas con un segmento lineal de DNA plasmídico (moléculas de DNA circular) que lleva
el gen de interés EPSPs, el cual codifica para una enzima que otorga tolerancia al herbicida glifosato. El
fragmento plasmídico cuenta además con el gen NPTII que proporciona resistencia al antibiótico
geneticina, lo que permite seleccionar in vitro las células transformadas. Hasta el momento se
bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de
los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107
eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos
eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión
Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia
del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés Polymerase Chain
Reaction) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del
transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la
correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada
por ensayos de northern y/o RT-PCR (del inglés retrotranscription PCR).uidA) que permite detectar
visualmente la incorporación del mismo en el genoma de las células vegetales. Esto permitió ajustar los
parámetros involucrados y optimizar el proceso de transformación de tejido calloso con el gen de
interés, como así también optimizar la regeneración de plantas a partir de callos embriogénicos. Para la
obtención de los callos embriogénicos utilizados como explantes, se cultivaron in vitro discos de ápice
caulinar de caña de azúcar. Una vez obtenidos, los callos fueron bombardeados con partículas de
tungsteno recubiertas con un segmento lineal de DNA plasmídico (moléculas de DNA circular) que lleva
el gen de interés EPSPs, el cual codifica para una enzima que otorga tolerancia al herbicida glifosato. El
fragmento plasmídico cuenta además con el gen NPTII que proporciona resistencia al antibiótico
geneticina, lo que permite seleccionar in vitro las células transformadas. Hasta el momento se
bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de
los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107
eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos
eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión
Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia
del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés Polymerase Chain
Reaction) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del
transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la
correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada
por ensayos de northern y/o RT-PCR (del inglés retrotranscription PCR).EPSPs, el cual codifica para una enzima que otorga tolerancia al herbicida glifosato. El
fragmento plasmídico cuenta además con el gen NPTII que proporciona resistencia al antibiótico
geneticina, lo que permite seleccionar in vitro las células transformadas. Hasta el momento se
bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de
los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107
eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos
eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión
Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia
del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés Polymerase Chain
Reaction) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del
transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la
correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada
por ensayos de northern y/o RT-PCR (del inglés retrotranscription PCR).NPTII que proporciona resistencia al antibiótico
geneticina, lo que permite seleccionar in vitro las células transformadas. Hasta el momento se
bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de
los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107
eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos
eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión
Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia
del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés Polymerase Chain
Reaction) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del
transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la
correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada
por ensayos de northern y/o RT-PCR (del inglés retrotranscription PCR).