Estudio cinético de la Na,K-ATPasa usando la sonda fluorescente RH421

SCHVARTZ, PG; MONTI, JLE; GONZÁLEZ LEBRERO, RM; KAUFMAN, SB; GARRAHAN, PJ; ROSSI, RC

Mar del Plata, Argentina

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas; 2004

SAIC, SAI, SAFE, SABiología, SABiofísica, SAN, SAF

La Na,K-ATPasa es una proteína de membrana que acopla el intercambio de Na+ por K+ a la hidrólisis de ATP. Durante el ciclo de reacción se forman intermediarios fosforilados en dos estados conformacionales de la enzima, denominados E1P y E2P. La concentración total de los estados fosforilados puede ser medida utilizando [gamma-32P]ATP. Recientemente hemos comenzado a utilizar la sonda fluorescente RH 421 que detectaría exclusivamente el confórmero E2P. El objetivo del presente trabajo es estudiar la fluorescencia de la sonda RH421 en la Na+/K+-ATPasa, con el fin de evaluar su utilidad para dilucidar el mecanismo cinético de la enzima. Utilizando un fluorómetro de ?stopped flow? y trabajando a 25°C, se obtuvieron registros de fluorescencia de RH421 en función del tiempo luego de mezclar la enzima con ATP en diferentes concentraciones. El medio final contenía Na+ 150 mM, Mg2+ 0.5 mM e Imidazol-HCl 25 mM, pH=7.5. Los resultados muestran que al agregar ATP la fluorescencia aumenta rápidamente, manteniéndose alta hasta caer abruptamente. La caída se debería al consumo del ATP ya que desaparece en presencia de un sistema regenerador. El aumento de fluorescencia parece reflejar la formación de E2P ya que el agregado de oligomicina, que bloquea el cambio conformacional E1P->E2P sin impedir la formación de E1P, lo anula completamente. De registros obtenidos con [ATP] entre 0.1 y 50 µM, se obtuvieron el cambio máximo de fluorescencia y, gracias a un procedimiento desarrollado por nosotros, también la actividad ATPasa. Ambas magnitudes presentan un comportamiento hiperbólico respecto a la concentración de ATP, siendo sus K0,5 idénticos y comparables a los hallados en bibliografía y a medidas previas generadas en nuestro laboratorio. Podemos concluir que el estado de alta fluorescencia corresponde a un intermediario obligatorio del ciclo catalítico, posiblemente E2P, y que la sonda RH421 permite estimar la actividad ATPasa. Financian: UBA, ANPCyT, CONICET y F. ANTORCHAS.