Interacción entre Na+ y Rb+ con la Na+/K+-ATPasa

MONTI, JLE; SCHVARTZ, PG; GONZÁLEZ LEBRERO, RM; KAUFMAN, SB; GARRAHAN, PJ; ROSSI, RC

Mar del Plata, Argentina

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas; 2004

SAIC, SAI, SAFE, SABiología, SABiofísica, SAN, SAF

La Na+/K+-ATPasa es una proteína integral de membrana que acopla la hidrólisis de una molécula de ATP al intercambio de 3 Na+ del citoplasma por 2 K+ del medio extracelular. Su mecanismo de funcionamiento no se conoce claramente. Existen intermediarios de reacción en los que el K+ se halla ocluído (atrapado por la enzima). Con el fin de estudiar la interacción entre Na+ y Rb+ (un análogo del K+) con la enzima, se realizaron determinaciones de [86Rb]Rb+ ocluído (Rb-ocl). Se usó enzima purificada de la médula externa de riñón de cerdo. Las reacciones se hicieron a 25°C en medios conteniendo: enzima 37µg/ml, imidazol 25mM, EDTA 0.25mM, pH=7.4 a 25°C, 0.5mM de Mg2+ libre, Colina-Cl para mantener constante la fuerza iónica, y distintas concentraciones de ATP, NaCl y [86Rb]RbCl. Las reacciones se frenaron a los 10 segundos de iniciadas con una solución fría de KCl 30mM, imidazol 5mM, pH=7.4 a 2-4°C, y se filtró la mezcla reteniendo en el filtro la enzima con el [86Rb]Rb+ ocluido. Los resultados muestran que, a una concentración fija de Rb+ y concentraciones crecientes de Na+, Rb-ocl aumenta sigmoidalmente hasta alcanzar un máximo para luego caer hiperbólicamente a un valor distinto de cero. El ajuste de una ecuación de Hill a la parte sigmoidea de la curva muestra que el nH es cercano a 3 en todos los casos, coincidiendo con la estequiometría de la reacción, mientras que la Kh aumenta en forma saturable al incrementarse la concentración de Rb+ de 5 a 245 µM. A 10µM ATP, los resultados muestran que los valores de K0.5 de la caída hiperbólica aumentan linealmente con la concentración de Rb+, así como el nivel de Rb-ocl medido en ausencia de Na+. Los resultados pueden en general ser explicados por el modelo cinético aceptado actualmente (modelo de Albers-Post), a excepción de la caída de Rb-ocl a un valor distinto de cero cuando la concentración de Na+ tiende a infinito. Dicho modelo plantea que el Na+ compite con el Rb+ por los sitios de oclusión y, si esto fuera cierto, Rb-ocl debería tender a cero a medida que aumenta la concentración de Na+. (UBA-CONICET)