Efectos del Na+ y del ATP sobre la constante de velocidad de desoclusión de Rb+ de la Na+/K+-ATPasa

MONTI, J. L. E.; SPIAGGI, A. J.; SCHVARTZ, P. G.; ROSSI, R. C.; GARRAHAN, P. J.

Bernal, Buenos Aires, Argentina

Taller; Biofísica de macromoléculas: aspectos estructurales e implicancias biológicas y biotecnológicas; 2007

Sociedad Argentina de Biofísica

El mecanismo catalítico del transporte de Na+ y K+ por la Na+/K+-ATPasa no se conoce detalladamente. Existen intermediarios de reacción en los que el K+ se halla ocluido (atrapado en la enzima). A concentraciones saturantes de Na+ y K+, el paso limitante del ciclo es la desoclusión del K+, siendo el ATP capaz de acelerar esta reacción unas 200 veces. En el presente trabajo demostramos que dicho efecto es modulado por la concentración de Na+. Se emplearon fragmentos de membrana conteniendo Na+/K+-ATPasa purificada a partir de la médula externa del riñón de cerdo según se describe en [1]. El intermediario ocluído con Rb+ (un análogo del K+) se obtuvo incubando la enzima a 25ºC en un medio conteniendo [86Rb+]RbCl, imidazol-HCl 25mM, EDTA 0.25mM, pH=7.4 hasta alcanzar el equilibrio. Luego se incubó distintos tiempos a 25ºC en medios conteniendo 0.01 o 2.5mM ATP, 0.5mM de Mg2+ libre, imidazol-HCl 25mM, pH=7.4, y diferentes concentraciones de NaCl (0-170mM) empleando ColinaCl (una sal inerte) para mantener constante la fuerza iónica del medio de reacción. Al cabo de dicha incubación se cuantificó el Rb+ ocluído en la enzima tal como se describe en [2]. A 10μM ATP, la velocidad inicial de desoclusión disminuye con el incremento de [Na+]. El ajuste de una hipérbola brinda un valor aproximado de K0.5 de 104±37mM. A 2500μM ATP, en cambio, la velocidad de desoclusión aumenta hiperbólicamente a medida que la concentración de Na+ aumenta de 0 a 100mM con una K0.5 de 18±4mM, pero a concentraciones aún mayores la velocidad comienza a disminuir. Si bien el efecto activador del Na+ a alta [ATP] es conocido (ver [3]), hasta ahora no se había detectado la inhibición a mayores concentraciones del catión, lo cual indicaría la presencia de al menos 2 sitios de unión para el Na+ en E2(Rb2)ATP.