Estudio cinético del mecanismo de reacción de la H+/K+-ATPasa

MONTES, M. R.; MONTI, J. L. E.; GONZÁLEZ-LEBRERO, R. M.; SPIAGGI, A. J.; GARRAHAN, P. J.; ROSSI, R. C.

Bernal, Buenos Aires, Argentina

Taller; Biofísica de macromoléculas: aspectos estructurales e implicancias biológicas y biotecnológicas; 2007

Sociedad Argentina de Biofísica

La H+/K+-ATPasa es una enzima perteneciente a la familia de las ATPasas transportadoras de cationes de tipo P que incluye, entre otras, a la Na+/K+-ATPasa y la Ca2+-ATPasa.La H+/K+-ATPasa se encuentra localizada en la membrana de las células parietales de estómago y es responsable de la acidificación del jugo gástrico. Durante su funcionamiento transporta dos iones K+ hacia el interior y dos iones H+ hacia el exterior celular a expensas de la hidrólisis de una molécula de ATP. Presenta grandes similitudes con la Na+/K+-ATPasa ya que comparten la secuencia de aminoácidos en un 63 % y ambas están compuestas por una subunidad alfa y una subunidad beta.En este trabajo realizamos experimentos tendientes a caracterizar cinéticamente el comportamiento de la H+/K+-ATPasa y cotejamos su funcionamiento con el de la Na+/K+-ATPasa para determinar hasta qué punto estas ATPasas comparten los pasos e intermediarios de reacción durante el transporte de cationes. Utilizamos vesículas enriquecidas con H+/K+-ATPasa que presentaron una actividad dependiente de K+ de aproximadamente 60 mmolPi/(mg h). Dicha actividad es significativamente aumentada por la presencia de nigericina, un ionóforo que permite la entrada de K+ a las vesículas, y es inhibida totalmente por vanadato+Mg. El coeficiente de velocidad de fosforilación en presencia de 40 mM ATP (70 s-1), así como la disminución de fluorescencia de la enzima marcada con eosina debida al K+, son similares a los observados en la Na+/K+-ATPasa. Sin embargo parecen existir diferencias con respecto a la formación del intermediario con Rb+ ocluído (congénere del K+). Observamos que la unión de Rb+ en función del tiempo es descripta por la suma de dos funciones exponenciales crecientes cuyo componente rápido podría corresponder a la formación del intermediario con Rb+ ocluído y el lento al ingreso de Rb+ a las vesículas por transporte pasivo. Esta posibilidad será evaluada utilizando inhibidores específicos de la bomba y su efecto en la unión u oclusión de Rb+ en la H+/K+-ATPasa.