PRECIPITACIÓN SELECTIVA DE TRIPSINA UTILIZANDO POLÍMEROS DE CADENA FLEXIBLE CARGADOS COMO ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN

BRAIA, MAURICIO; PICÓ, GUILLERMO; ROMANINI, DIANA

Rosario

Congreso; IX Congreso - XXVII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2007

Sociedad de Biología de Rosario

La tripsina es una proteína producida en el páncreas exócrino bajo la forma de zimógeno inactivo, el tripsinógeno. Es secretada al intestino delgado, donde es activada por enteroquinasas. La tripsina activada actúa, a su vez, sobre otras moléculas de tripsinógeno provocando un fenómeno de autocatálisis o autoactivación. Sólo una pequeña cantidad de enteroquinasa es necesaria para comenzar la reacción. La tripsina es considerada una proteína de alto valor comercial puesto que es utilizada  en numerosos procesos industriales y  biotecnológicos. El objetivo de nuestro trabajo fue determinar el mecanismo molecular de la interacción entre tripsina y un polielectrolto negativamente cargado: polivinilsulfato de sodio (PVS) como herramienta para la separación de dicha proteína de un extracto natural. Para alcanzar el objetivo propuesto, hemos utilizado técnicas espectroscópicas y calorimétricas las cuales mostraron que la máxima turbidez a 20°C ocurre a una relación molar polímero/proteína de 1:125, a pH 3 y en ausencia de sales en el medio. La redisolución del complejo insoluble se logra de dos maneras alternativas. Una es por agregado de una solución de buffer fosfato de pH 7, al cual este complejo es soluble. La otra, adicionando una solución de fuerza iónica elevada, en este caso NaCl de concentración 0,5M en buffer fosfato pH 3. La actvidad enzimática de tripsina se determinó utilizando el sustrato  a-N-benzoil-L-Arginine-p-nitroaniline (BAPNA). El valor de la actividad se determinó como la pendiente de la curva absorbancia vs. tiempo. Se determinaron, tanto los valores de actividad de la enzima en presencia de polímero como la estabilidad en el tiempo de la enzima en presencia de éste. Se observó que la acividad enzimática no sufre una disminución significativa en presencia de PVS, y que no se ve modificada a lo largo de 24hs cuando se la incuba a 20°C. La curva de calorimetría de titulación isotérmica mostró que la proteína se fija al polímero siguiendo un modelo de un único tipo de sitios con DH negativo, acorde con una interacción electrostática entre polímero y proteína. Los resultados obtenidos permitieron caracterizar las condiciones de formación, precipitación y disolución de los complejos insolubles para poder ser aplicados a la bioseparación de tripsina a partir de su fuente natural.