Bloqueo del CFTR por glibenclamida en células K562.

ASSEF Y. Y KOTSIAS BA.

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2002

Sociedad Argentina de Biofísica

La línea celular K562 deriva de una leucemia mieloide humana y se encuentra arrestada en estadíos muy tempranos de su diferenciación. Los canales iónicos en células sanguíneas están involucrados en diferentes funciones como el control del potencial de membrana, diferenciación celular,  regulación del volumen, y activación de células T, entre otras.El canal de cloruro regulador de la conductancia en la fibrosis quística (CFTR) es una proteína regulada por fosforilación y presencia de nucleótidos. Mutaciones en el gen que codifica para el CFTR determinan la fibrosis quística.Previamente demostramos que las células K562 expresan en su membrana CFTR e identificamos una corriente activada por forskolina, un activador de la adenilato ciclasa, que muestra una relación corriente-voltaje lineal, con conductancia unitaria de 11.4 pS y potencial de reversión cercano a 0 mV, compatible con el CFTR. La glibenclamida es una sulfonilurea empleada como bloqueante del CFTR. La caracterización del bloqueo del canal se realizó con la técnica de patch clamp en la configuración excised inside-out. El agregado de glibenclamida (25-100 µM) del lado citoplasmático causa un aumento  reversible de las transiciones entre los estados abierto y cerrado del canal que se manifiesta como una reducción de la probabilidad de apertura, Po ± SD, control = 0.50  ±  0.19;   glibenclamida   50   µM  =  0.13  ± 0.08, n = 5, (p<0.01).  La disminución de Po es dependiente del voltaje, produciéndose la máxima inhibición a potenciales de membrana hiperpolarizantes y no modifica la amplitud del canal. A -80 mV,  la concentración que disminuye la Po a la mitad (Ki) es 42.25 ± 4.56 µM, n=3. El  estudio de la cinética del canal único, demostró que la reducción de la Po se debe a una disminución de la constante de tiempo abierto: 23.2 ± 7.1 ms y 2.1 ± 1.4 ms para las soluciones control y con el agregado de glibenclamida, respectivamente   ( p<0.01). Esto indica que la glibenclamida sería un bloqueante del canal abierto.La constante de disociación (Kd) de la glibenclamida sobre el CFTR es voltaje dependiente y sugiere que el bloqueante posee un sitio de unión en el interior del poro. La distancia eléctrica sensada por la glibenclamida es 0.23, medida desde el lado intracelular. En conclusión la glibenclamida es un bloqueante del CFTR en el estado abierto y  su sitio de unión es en un dominio intracelular de la proteína, comportamiento similar al descrito en células de origen epitelial En conclusión la glibenclamida es un bloqueante del CFTR en el estado abierto y  su sitio de unión es en un dominio intracelular de la proteína, comportamiento similar al descrito en células de origen epitelial En conclusión la glibenclamida es un bloqueante del CFTR en el estado abierto y  su sitio de unión es en un dominio intracelular de la proteína, comportamiento similar al descrito en células de origen epitelial