Desarrollo de una Estrategia de Colaboración para Contribuir al Diagnóstico de Diarreas Asociadas a Clostridium Difficile.

TREJO, FM; RUSCONI, ME; GUZZETTI, L; SERRADELL, M; HUMEN, MA; ZAMBONI, MI; GUARDATI, MC; LEJONA, S; ROLLET, R; PEREZ, PF.

Córdoba-Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología. Asociación Argentina de Microbiología.; 2007

Clostridium difficile, bacilo G(+) formador de esporos, es el principal responsable de las diarreas asociadas a antibióticos. Pacientes cuya flora normal intestinal ha sido desbalanceada por la administración de antibióticos o antineoplácicos pueden ser colonizados por este patógeno oportunista. Una vez establecido en el tracto gastrointestinal produce como principales factores de virulencia dos toxinas, TcdA (enterotoxina) y TcdB (citotoxina). Existen diferentes métodos de diagnosis las cuales van desde la detección de las toxinas empleando kit inmunológicos comerciales hasta la detección del gen que codifica para estas (tcdA, tcdB) por PCR. En el presente trabajo se evaluaron diferentes métodos que permiten evaluar la presencia de tcdB por PCR y técnicas inmunológicas empleando anticuerpos monoclonales comerciales contra TcdA y TcdB. Como método de referencia para la detección de TcdB se realizaron ensayos de citotoxicidad sobre células en cultivo (línea Vero), cuyo efecto produce un redondeo y desprendimiento celular característico. Se analizaron muestras de pacientes que presentaban cuadros de diarrea y que previamente habían recibido tratamiento con antibióticos. De cada muestra obtenida, una parte fue ensayada para detectar tcdB y el resto se resuspendió en igual volumen de buffer PBS, se centrifugó y el sobrenadante se filtró en condiciones asépticas de estériles. Diluciones seriadas de los sobrenadantes (SN) así obtenidos fueron testeados por su actividad citotóxica y la presencia de TcdA TcdB mediante la técnica de dot blot. Para la obtención y purificación de toxinas de Clostridium difficile se empleo la cepa de referencia ATCC 9689 crecida en bolsas de diálisis equilibradas contra BHI y crecidas por 72hs en anaerobiosis. Se recupero el sobrenadante contenido en las bolsas, se concentró y lavó con 200ml de Buffer tris 50mM pH 7.5 empleando un equipo de filtración forzada con membrana de poro 10kDA (AMICON). El extracto así obtenido se sembró en una columna de intercambio aniónico para separar las toxinas las cuales serán utilizadas para la obtención de anticuerpos monoclonales. En el ensayo sobre cultivo celular ciertos SN presentaban actividad citotóxica provocando un redondeo y desprendimiento característico de TcdB. Los dot blot permitieron detectar la presencia de ambas toxinas en los SN analizados. En ambas técnicas se realizaron diluciones seriadas de las muestras para descartar la existencia de reactividad cruzada o inespecífica. La puesta a punto estas técnicas y los anticuerpos monoclonales permitirá poner a punto una metodología adecuada para el desarrollo de un método rápido y confiable en el diagnostico de Clostridium difficile.