Estudio del desarrollo de Clostridium difficile en biofilm mixto con Bifidobacterium bifidum CIDCA 5310.

TREJO FM; AYELÉN A. HUGO; MINNAARD J,; PEREZ PF

Congreso; XXII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología; 2016

Estudio del desarrollo de Clostridium difficile en biofilm mixtocon Bifidobacterium bifidum CIDCA5310 Trejo, FM(1); Hugo, AA(1), Minnaard, J (1); Pérez, PF(1,2).  (1)CIDCA-UNLP-CONICET CCT La Plata, (2) Cátedra de Microbiología, FCE  UNLP, Buenos Aires,  ArgentinaClostridium difficile (CD) esun bacilo esporulado, que puede inducir diarrea y colitis pseudomembranosadebido a su capacidad de producir toxinas A y B. En los últimos años, se hanobservado cambios en la patogénesis de C.difficile asociado con la aparición de nuevas cepas. Esto a generadocambios  en las poblaciones de riesgo, conaumento en la incidencia y severidad de las infecciones. En este contexto, laformación de biofilm ha surgido como nuevo factor de virulencia a considerar enlas infecciones por C. difficile. Objetivo: Evaluar el efecto de Bifidobacterium bifidum, cepa CIDCA 5310(BB) sobre desarrollo en biofilm, actividad biológica, viabilidad yesporulación de CD cepa 117. Materialesy Métodos: Cultivos puros de CD y mixtos  de ambas especies (CM) se sembraron enBHI-cisteína sobre placas de policarbonato de 24 pocillos. Como control seemplearon fosas con BHI sin sembrar. Cada cepa se sembró a DO600 =0,05 y se incubó en anaerobiosis a 37ºC durante diferentes tiempos. Eldesarrollo de biofilm se evaluó mediante coloración con cristal violeta y seexpresó como un factor de biofilm (Fbiof)  = Abs570nmMuestra - Abs570nmControl.La actividad biológica se evaluó sobre células Vero en cultivo y posteriorobservación microscópica del redondeo producido. Definimos unidades arbitrarias(UA) como la inversa de la dilución que produce el 100 % del redondeo celular.Viabilidad y esporulación se cuantificaron por recuento en placa. La estructuradel biofilm se evaluó a través de  microscopia electrónica de barrido. Secuantificaron proteínas totales y carbohidratos por método de Bradford y de laAntrona respectivamente. Resultados:CD y CM desarrollan biofilm a niveles máximos con diferencias significativas aldía 4; alcanzando valores de Fbiof CD = 0,29 ± 0,04 y FbiofCM = 0,9 ± 0,1 p<0.001). Al día 6 para CM el biofilm se reducesignificativamente (Fbiof CM = 0,53 ± 0,02, p<0.05) y alcanzaniveles similares que para CD (Fbiof CD = 0,38 ± 0,05). La actividadbiológica de CD alcanzó valores de 4 UA al día 1 y llego a 8 UA al día 6,mientras que para CM se mantuvo <2 UA para todo el período de estudio. Elbiofilm de CM presenta una reducción significativa en la cantidad de esporospresentes al día 6 respecto a CD (Log10 UFC/ml = 6,0 ± 0,1 y 4,8 ±0,1 respectivamente) lo cual fue confirmado mediante microscopía electrónica. Nose observaron diferencias significativas en el desarrollo de célulasvegetativas. Además, mediante microscopía electrónica se observó la presenciade una matriz polimérica de naturaleza proteica formando el biofilm que rodea aambas especies. Conclusiones: los resultados muestran que los biofilms mixtosentre C. difficile y B. bifidum se forman en menor tiempo quelos constituidos solamente por C.difficile y, aunque la viabilidad de los clostridios no se ve afectada, laactividad biológica debida a las toxinas y la esporulación disminuyensignificativamente. Estos hallazgos sugerirían que existe una comunicaciónentre las dos especies favorecida por el crecimiento en biofilm.