Purificación de la toxina a de Clostridium difficile y Obtención de anticuerpos monoclonales

TREJO, FM; SERRADELL, M; RUSCONI, ME; GUZZETTI, L; PEREZ, PF

Rosario, Arg

Congreso; XIII Jornadas Arg.s de Microbiología. Asociación Arg. de Microbiología; 2008

Clostridium difficile es un bacilo Gram (+) formador de esporos cuyos principales factores de virulencia son las toxinas A (TcdA) y B (TcdB). En pacientes hospitalizados, el tratamiento con antineoplásicos o antibióticos propicia condiciones favorables para la colonización por Clostridium difficile, que es responsable del 90-100 % de los casos de colitis pseudomembranosa y del 60-75% de colitis asociada a antibióticos. Los métodos más empleados para el diagnostico de infecciones por C. difficile toxigénicos se basan en enzimoinmunoensayos (EIA) que detectan toxinas (TcdA/TcdB), ensayos sobre células en cultivo (detectan fundamentalmente TcdB) y  PCR (detección de los genes que codifican para las toxinas). En nuestro país, los kits diagnósticos deben importarse a un costo elevado. Teniendo en cuenta que, por su menor efecto citopático, la detección de la TcdA no puede realizarse fácilmente por ensayos sobre células, el presente trabajo tuvo como objetivos la purificación de la TcdA y la obtención de anticuerpos monoclonales (AcMo). Sobrenadantes de la cepa de C. difficile VPI 10463 crecida en BHI, fueron concentrados por ultra filtración (cut-off 100 kDa). El concentrado se purificó por HPLC de intercambio iónico (DEAE Sepharose Fast-Flow) en gradiente de ClNa. TcdA eluyó en el rango de concentración entre 270 mM y 350 mM mientras que la toxina B lo hizo entre 450mM y 550mM. Las fracciones correspondientes a TcdA y TcdB fueron confirmadas por dot blot con anti-TcdA y anti-TcdB comerciales. El proceso de purificación  se siguió por electroforesis SDS-PAGE. Las fracciones correspondientes a TcdA se concentraron y se precipitaron a pH 5. Los AcMo fueron obtenidos empleando la técnica de hibridación de células somáticas de Galfe y Milstein. Ratones BALB/c fueron inmunizados con 3 inoculaciones por vía intraperitoneal con TcdA inactivada con formaldehído en adyuvante de Freund. Al termino del plan de inmunización, el animal con mayor título de anticuerpo en suero fue sacrificado y sus células de bazo fueron fusionadas con la línea celular de mieloma murino (NSO). Se obtuvieron tres hibridomas productores de AcMo capaces de reconocer TcdA  purificadas y en filtrados fecales con TcdA mediante  dot-blot e inmunoblotting. Estos resultados demuestran la potencialidad de los anticuerpos obtenidos para ser aplicados en el diagnóstico de diarreas asociadas a Clostridium difficile.