Estudio sobre el efecto de bifidobacterias en el crecimiento, esporulación y producción de toxinas de Clostridioides difficile.

SOLDAVINI PELICHOTTI, P. CECILIA; TREJO FERNANDO M; PEREZ, PABLO F.

Congreso; XIX Jornadas Argentinas de Microbiología; 2021

Clostridioides difficile (CD) es el principal causante de diarreas asociadas al uso de antibióticos y cuya forma de diseminación e infección son los esporos. Su virulencia está asociada a las toxinas: TcdA, TcdB y CDT. Como alternativa a terapias con antibióticos, se han propuesto estrategias basadas en probióticos como Bifidobacterium, para prevenir y/o tratar infecciones por CD. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de bifidobacterias sobre el crecimiento, la esporulación y la producción de toxinas de C. difficile. Se estudiaron 3 aislamientos clínicos de CD (ALCD3, GCD4 y GCD2) y la cepa de referencia VPI10463, y 3 cepas de bifidobacterias B. pseudolongum (531), B. bifidum (5310) y B. adolescentis (5317). Se realizaron cultivos puros de CD (Cp) o co-cultivos con bifidobacterias (Cb) en caldo BHI. Se determinaron formas totales de CD (FT) mediante recuento en DCM-agar suplementado con taurocolato de sodio. Las formas termo-resistentes (FTR) se evaluaron mediante tratamiento a 65°C por 20 minutos y posterior recuento. Se calculó la relación de termo-resistencia (T-R) como: FTR / FT. Mediante microscopía, se establecieron proporciones de esporos libres (PLCp o PLCb). La producción de toxinas se evaluó sobre células Vero en cultivo, las cuales se trataron con sobrenadantes libres de células (SLC) de Cp o Cb. Se definió el daño citopático 50 (DC50) como la concentración (%v/v) de SLC que produce redondeo del 50% de las células. No se encontraron diferencias significativas entre los recuentos de FTCp y FTCb para las diferentes cepas de CD evaluadas a 24hs. Los rangos de valores fueron los siguientes: 2x107 - 6x107 UFC/ml (ALCD3), 3.8 x106 ? 1.1x107 UFC/ml (GCD4) y 2.5 x107 ? 3.8x107 UFC/ml (VPI 10463) y 5.5 x107- 9.2 x107 UFC/ml (GCD2). Con relación a la termoresistencia, para la cepa ALCD3 se obtuvieron los siguientes valores T-RCp: 0.25±0.01, y TRCb: 0.13±0.04, 0.11±0.04 y de 0.005±0.001 para las cepas 5310, 531 y 5317 respectivamente. Para GCD4 T-RCp:0.020±0.002, T-RCb5310: 0.0017±0.0004, T-RCb531:0.0003±0.0001 y T-RCb5317:0.002±0.001. Para GCD2 T-RCp:0.04±0.02 T-RCb5310:0.10±0.07, T-RCb531:0.01±0.007 y T-RCb5317:0.002±0.001. Para VPI10463, T-RCp:0.020±0.004 T-RCb5310:0.06±0.01, T-RCb531:0.31±0.004 y T-RCb5317:0.018±0.001. En las dos últimas cepas, no se encontraron diferencias significativas entre los valores de T-RCp y T-RCb. Sólo en los cultivos de la cepa ALCD3 se encontraron esporos libres por microscopía. Los valores fueron los siguientes: PLCp: 0.17, PLCb5310: 0.05, PLCb531: 0.05, y PLCb5317: 0.001, encontrándose diferencias significativas entre PLCp y las PLCb. Respecto a la actividad biológica, ALCD3, DC50Cp fue de 0.05% y en los co-cultivos, DC50Cb:0.20%. Para GCD4 EC50Cp:0.15%, EC50Cb5310:0.78%, EC50Cb531:12.50% y EC50Cb5317:0.98%. Los valores de EC50 para VPI10463 y GCD2 fueron cercanos a 6x10-4 y 0.036 respectivamente. Durante el crecimiento en co-cultivo las bifidobacterias no inhibieron el crecimiento de C. difficile. Sin embargo, indujeron un retraso en la esporulación y disminución en la actividad biológica asociada a las toxinas, en al menos dos aislamientos clínicos evaluados. Estos resultados muestran una interacción entre ambas especies que resulta de interés para el potencial uso de las bifidobacterias en el control de C. difficile.