Detección de Clostridium difficile mediante técnicas inmunoquímicas y su relación con el ensayo sobre células en cultivo

FERNANDO M TREJO, PABLO F PÉREZ

“Clínicas de infectológicas del Hospital Muñiz.

editado por Alfredo Seijo, Lautaro de Vedia, Marcelo Corti, Humberto Metta

Año: 2009; p. 67 - 76

Clostridium difficile es un bacilo Gram positivo formador de esporos que se encuentra ampliamente diseminado en el ambiente de centros nosocomiales. Esta situación es especialmente problemática para pacientes sometidos a tratamientos con antibióticos o agentes antineoplásicos que sufren una desbalance en su microbiota intestinal normal. Este desbalance permite la colonización del tracto gastrointestinal por dicho patógeno o el sobrecrecimiento de cepas ya presentes en el intestino del paciente. El microorganismo produce como principales factores de virulencia dos toxinas: toxina A (TcdA, enterotoxina de  308 kDa) y toxina B (TcdB, citotoxina de 206 kDa). Datos aportados por el sistema de salud de Estados Unidos, revelan que el número estimado de casos de enfermedades asociadas a C. difficile excede los 250.000 por año causando un gasto anual de U$S 1.000.000.000 al sistema de salud. Tanto en Europa como en Canadá y en los Estados Unidos, se han incrementado las denuncias de brotes de infecciones asociadas a C. difficile. Un estudio realizado en un hospital en Canadá, demostró que la incidencia de C. difficile había aumentado de 35,6  por cada 100.000 internados en 1991 a 156,3 cada 100.000 en 2003. En el mismo período, la proporción de complicaciones aumentó de 7,1 % a 18,2 % y la mortalidad dentro de los 30 días pasó de 4,7 % a 13,8 % [1]. Las infecciones causadas por C. difficile conducen a cuadros que van desde diarrea, colitis, colitis pseudomembranosa fulminante (CPM), megacolon tóxico y en casos severos puede conducir a la muerte del paciente. En este contexto, C. difficile es responsable del 90-100 % de los casos de colitis pseudomembranosa, 60-75% de los casos de colitis asociado a antibióticos y del 30-60 % de los casos de diarrea asociada a antibiótico (AAD). Entre un 2-11 % de los individuos adultos colonizados por cepas de C. difficile toxigénicas son asintomáticos. Es llamativo el hecho que, en neonatos, el porcentaje de portadores asintomáticos alcanza valores del 70 %. Esto podría atribuirse a la ausencia de receptores para las toxinas en los enterocitos del tracto digestivo inmaduro. Los principales factores asociados a las infecciones por C. difficile son el uso de antibióticos de amplio espectro como amoxicilinas, clindamicina y cefalexinas de 3ra generación. El uso de fluoroquinolonas está mas fuertemente correlacionado con las infecciones por C. difficile que el uso de beta lactámicos e inhibidores de beta lactámicos [2]. Estos factores de riesgo se incrementan con largos períodos de tratamiento junto con el empleo de agentes antimicrobianos adicionales. Otros factores importantes son la edad avanzada (pacientes mayores de 65 años), la internación prolongada y la admisión a unidades de cuidados intensivos. Pacientes tratados con inmunosupresores, sometidos a cirugías recientes o que previamente hayan sufrido diarrea asociada a C. difficile, presentan un mayor riesgo de sufrir una colitis fulminante. Los primeros indicios que llevan a presumir de infecciones causadas por C. difficile están basados en el reconocimiento de los síntomas clínicos en el paciente entre los cuales se destacan diarreas acuosas, dolores abdominales, pérdida de apetito, náuseas y fiebre [3]. Además de estos síntomas el paciente debe presentar historia de tratamiento con antibiótico o antineoplásicos dentro de las 8 semanas previas a la manifestación del cuadro clínico. Como consecuencia del agravamiento de la colitis pueden desencadenarse severos cuadros secundarios entre los cuales se destacan sepsis, desbalance de electrolitos, hipotensión, peritonitis y en algunos casos elevado recuento de glóbulos blancos con altos niveles de creatinina [4]. El reconocimiento de los síntomas no es suficiente para el diagnóstico de C. difficile como agente responsable de la enfermedad, ya que pueden existir otros patógenos entéricos como Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Candida spp. y Staphylococcus aureus [5] u otras enfermedades como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerativa las cuales provocan síntomas similares. Cuando existe la sospecha de que C. difficile es el agente etiológico del cuadro, se debe realizar la confirmación por colonoscopía o por algún método de diagnóstico de laboratorio. La colonoscopía permite ver las úlceras desarrolladas en el colon por la colitis pseudomembranosa, sin embargo es un método muy poco sensible para estadios tempranos de la infección. Los métodos más comúnmente utilizados para el diagnóstico se basan en aislamientos del patógeno, ensayos de detección de moléculas características, de toxinas o de los genes que las producen. El aislamiento de la bacteria tiene la desventaja que no permite distinguir cepas toxigénicas y no toxigénicas por lo que se debe complementar con algún método que permita detectar toxinas [6]. Otro de los métodos empleados se basa en la detección del antígeno común de superficie (glutamato deshidrogenasa; GDH). Si bien el método es rápido, también debe ser confirmado por otro método que detecte toxina dado que dicha enzima también está presente en cepas no toxigénicas de C. difficile. El método de referencia o “gold standard” para el diagnóstico de C. difficile es el ensayo de citotoxicidad de filtrados fecales sobre células en cultivo [7]. Sin embargo, no se hallan estandarizadas las condiciones del ensayo pudiendo existir diferencias según la edad y la línea celular que se emplee, las diluciones que se hagan de las muestras y la experiencia del operador. La confirmación de la presencia de toxina debe realizarse mediante su neutralización empleando anticuerpos monoclonales específicos [3]. También existen métodos basados en técnicas inmunológicas para la detección de toxinas de C. difficile los cuales permiten detectar toxina A (ToxA) o la presencia de alguna de ellas sin diferenciar entre ambas (ToxA/B). Otras técnicas se encuentran basadas en métodos moleculares, e implican la detección del gen que codifica para TcdB (tcdB) mediante PCR en tiempo real. Estos métodos son rápidos pero requieren de equipamiento y personal especializado. En la tabla 1 se resumen los métodos mas utilizados para el diagnóstico de infecciones ocasionadas por C difficile. Actualmente, el diagnóstico en nuestro país se realiza a través de kits comerciales de tipo ELISA, también llamados enzimoinmunoensayos (EIA), que detectan antígeno común, TcdA o aquellos que detectan en forma indistinta toxina A y/o B. Estos dos tipos de kits son importados y en algunos casos de difícil adquisición en muchos de los centros de salud de nuestro país. Los principales marcadores de infecciones asociadas a C. difficile son las toxinas A y B producidas por este patógeno. En el presente capítulo se discutirán, los resultados obtenidos en la detección de TcdA y TcdB por métodos inmunoquímicos de tipo dot-blot artesanal y tipo ELISA comercial, frente al método biológico de referencia.