Estudio de la eficiencia de distintas proteínas fluorescentes para el estudio de la vía secretoria en hojas de Nicotiana Benthamiana y tabacum.

SCABONE, CAMILA MARIA; VECCHI, BRUNO; PETRUCCELLI, SILVANA

Rosario

Congreso; XIII Reunión Latinoamericana y XXVII Reunión Argentina de Fisiología Vegetal,; 2008

Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal,

El empleo de proteínas fluorescentes (FPs) como marcadores de distintos compartimientos subcelulares es una de las herramientas actuales más valiosas para estudios de biología celular en plantas. En especial, los estudios de colocalización utilizando FPs de ubicación subcelular conocida, requieren que estas posean espectros de excitación/emisión no coincidentes y que se expresen de forma nativa en el compartimiento subcelular apropiado. Las distintas FPs disponibles difieren en su brillo, vida media y estabilidad al pH, por lo que es necesario conocer y evaluar cuáles son los marcadores fluorescentes de organelas que ofrecen mayor estabilidad para cada compartimiento subcelular. En este trabajo se utilizaron distintas versiones de la eGFP, eYFP y mCherry para estudiar el transporte de proteínas a lo largo de la vía secretoria, dado que esta vía presenta compartimientos difíciles de marcar debido a su pH acídico. Se emplearon versiones de retículo endoplásmico (ERFP), tonoplasto (VL-FP) y membrana plasmática (membFP) y se ajustó un protocolo de expresión transiente en Nicotiana benthamiana y tabacum. Los ensayos fueron evaluados mediante la utilización de una lupa-UV, microscopía confocal y espectroscopía de fluorescencia. Los resultados muestran que las FPs con señales de direccionamiento a membrana plasmática tuvieron mayor intensidad de fluorescencia que las direccionadas al ER. La mayor intensidad se obtuvo con la YFP. La utilidad de estos reporteros fue comprobada en ensayos de colocalización con construcciones basadas en fusiones YFP-gama inmunoglobulina y mCherry-señal de direccionamiento del receptor vacuolar AtRMR1, enlos que fue posible identificar la ubicación subcelular de dichas fusiones.Nicotiana benthamiana y tabacum. Los ensayos fueron evaluados mediante la utilización de una lupa-UV, microscopía confocal y espectroscopía de fluorescencia. Los resultados muestran que las FPs con señales de direccionamiento a membrana plasmática tuvieron mayor intensidad de fluorescencia que las direccionadas al ER. La mayor intensidad se obtuvo con la YFP. La utilidad de estos reporteros fue comprobada en ensayos de colocalización con construcciones basadas en fusiones YFP-gama inmunoglobulina y mCherry-señal de direccionamiento del receptor vacuolar AtRMR1, enlos que fue posible identificar la ubicación subcelular de dichas fusiones.