Detección de diferentes marcadores vacuolares en Nicotiana Benthamiana y Arabidopsis thaliana.

SCABONE, CAMILA MARIA; PETRUCCELLI, SILVANA

Rosario

Congreso; REDBIO 2009 VII Simposio Nacional de Biotecnología y “II Congreso Internacional; 2009

REDBIO-FAO

Las plantas transgénicas constituyen un sistema de producción de proteínas recombinantes de interes. Una de las problemáticas más frecuentes que se plantean en este sistema, son los bajos niveles de acumulación de proteínas recombinantes que dependen de un balance entre síntesis y degradación. El direccionamiento de proteínas a  compartimientos vacuolares de reserva puede ser una manera para resolver este problema, sin embargo este direccionamiento seria dependiente de especie, tejido y tipo celular. En este trabajo, a fin de desarrollar herramientas que permitan evaluar el direccionamiento, se describe un protocolo de detección subcelular tanto en semillas como en hojas de diversos marcadores vacuolares. Se evalúa en Nicotiana Benthamiana marcadores vacuolares descriptos en Arabidopsis thaliana. Los marcadores empleados para vacuolas de almacenamiento proteico (PSV) fueron el L-RFP y el RFP-AFVY; y para las vacuolas líticas (LV) fue el mCherry-gammaTIP.  Luego con distintas versiones de la eGFP y eYFP fusionadas a señales de direccionamiento a retículo endoplásmico y el aparato de Golgi se estudio el mecanismo de trasporte de estos marcadores vacuolares a lo largo de la vía secretoria. Los ensayos fueron evaluados mediante la utilización de microscopía confocal y se encontro que proteínas fluorescentes que toleran pH acidicos serian mas adecuadas. La utilidad de estos reporteros fue comprobada en ensayos de colocalización con construcciones basadas en fusiones mGFP-señal de direccionamiento del receptor vacuolar AtRMR1, en los que fue posible identificar la ubicación subcelular de dicha fusión.