Determinación simultánea de mono y disacáridos derivatizados con ?ácido antranílico? por HPLC ? con detector de fluorescencia

CHEDIACK, JG; FASULO V; ANTÓN, R; CAVIEDES-VIDAL E

Merlo, San Luis

Congreso; III Congreso Argentino de Química Analítica; 2005

Asociación Química Argentina

DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE MONO  Y DI SACARIDOS DERIVATIZADOS CON ?ACIDO ANTRANÍLICO? POR HPLC ? CON DETECTOR DE FLUORESCENCIA.  Chediack, J1.; Fasulo V1; Antón, R2* y Caviedes ?Vidal, E1. Chediack, J1.; Fasulo V1; Antón, R2* y Caviedes ?Vidal, E1. (1)   Área de Qca. Analítica, (2) Área de Biología, UNSL, Chacabuco y Pedernera 5700-San Luis. rianton@unsl.edu.ar. (1)   Área de Qca. Analítica, (2) Área de Biología, UNSL, Chacabuco y Pedernera 5700-San Luis. rianton@unsl.edu.ar. La importancia de la determinación de sacáridos radica en el uso de azúcares inertes y no metabolizables como Ramnosa, L-arabinosa y Celobiosa en estudios de patologías clínicas de permeabilidad intestinal (e.g mala absorción o la enfermedad de Crohn) y  de 3-o-metil glucosa utilizada en estudios de absorción en patologías intestinales (e.g Síndrome del intestino corto). Estos estudios, generalmente son realizados en muestras de suero o plasma, que contienen otros monosacáridos como glucosa y fructosa, por lo cual se requiere de métodos rápidos, selectivos y de una sensibilidad adecuada para resolver micromuestras (Vol máximo 25 uL). En este trabajo se optimizó y validó un método de cromatografía en fase reversa con detector de fluorescencia, utilizando como derivatizante el ácido antranilico (Du & Acumula, 1998.), para la separación y cuantificación de monosacáridos tales como L-arabinosa, ramnosa, 3-O-metil-glucosa y el disacárido celobiosa. Se validó además la metodología de precipitación y separación de proteínas. El método se utilizó para estudios de absorción intestinal en distintos animales (palomas, ratas, cuises y murciélagos). La importancia de la determinación de sacáridos radica en el uso de azúcares inertes y no metabolizables como Ramnosa, L-arabinosa y Celobiosa en estudios de patologías clínicas de permeabilidad intestinal (e.g mala absorción o la enfermedad de Crohn) y  de 3-o-metil glucosa utilizada en estudios de absorción en patologías intestinales (e.g Síndrome del intestino corto). Estos estudios, generalmente son realizados en muestras de suero o plasma, que contienen otros monosacáridos como glucosa y fructosa, por lo cual se requiere de métodos rápidos, selectivos y de una sensibilidad adecuada para resolver micromuestras (Vol máximo 25 uL). En este trabajo se optimizó y validó un método de cromatografía en fase reversa con detector de fluorescencia, utilizando como derivatizante el ácido antranilico (Du & Acumula, 1998.), para la separación y cuantificación de monosacáridos tales como L-arabinosa, ramnosa, 3-O-metil-glucosa y el disacárido celobiosa. Se validó además la metodología de precipitación y separación de proteínas. El método se utilizó para estudios de absorción intestinal en distintos animales (palomas, ratas, cuises y murciélagos). Las muestras de plasma (extraídos con heparina) fueron desproteinizadas con acetonitrilo (calidad HPLC), centrifugadas y filtradas antes de someterse a una etapa de secado a  50 °C en estufa al vacío. Los residuos secos fueron derivatizados luego de resuspenderlos en acetato de sodio, con ácido antranílico - cianoborohidruro de sodio - acetato de sodio  y ácido bórico en metanol y se incubó 3 horas en estufa a 65°C. A temperatura ambiente se agrega solvente A (solución 0.2% n-butilamina, 0.5% ácido fosfórico, 1% tetrahidrofurano), se agita vigorosamente y se deja reposar unos minutos para que se termine de liberar el H2 producido por la reacción. Se utilizó para las corridas cromatográficas un Sistema HPLC Beckman Pump 126. Interface Beckman 406. Detector de Fluorescencia Gilson Model 121 con un filtro de exitación de 305-395 nm y de emisión de 450 (bandpass 40 nm). Se utilizó una columna C18 fase reversa (PICO-TAG, Waters Inc.) de 15 cm x 3.9 mm, a temperatura ambiente, y los Solventes: A (solución 0.2% n-butilamina, 0.5% ácido fosfórico, 1% tetrahidrofurano) y B (50% de acetonitrilo ? 50% de solvente A) . El tiempo total de corrida fue de 18 minutos, con un flujo de 0,8 mL/mim, y  rampas de solventes desde una relación 90:10 ? A:B; hasta una relación  82:18 ? A:B.  En estas condiciones cromatográficas se logró resolver celobiosa, glucosa, arabinosa, ramnosa y 3-O-metil glucosa, respectivamente. El límite de detección  fue de < a 1 ng en un loop de 20 ul, el %RSD fue alrededor de 0.2% en 6 injecciones de un estándar y la recuperación para cada azúcar después de la precipitación de proteínas fue entre el 70 y 80%. Ping Du & Anumula, K. R. 1998. Quantitative Analysis of Monosaccharides from Glycoproteins by Fast HPLC with Highly Sensitive Fluorescence Detection. Journal of Biomolecular Techniques. Vol. 9, N°4.