“Aspectos cinéticos y estructurales de las proteasas de frutos de “ihvirᔠ[Pseudoananas macrodontes (morr.) Harms, Bromeliaceae]”

CYNTHIA SEQUEIROS, LAURA M. I. LÓPEZ, CARLOS LLERENA SUSTER, SEBASTIÁN TREJO, CLAUDIA NATALUCCI Y NÉSTOR O. CAFFINI

Mar del Plata

Congreso; VII Congreso Argentino del Medicamento; 1998

Entre los múltiples usos que tienen las proteasas, las aplicaciones farmacológicas de las mismas siguen vigentes: a su conocido empleo como coadyuvantes digestivos y en la terapia antiinflamatoria se ha sumando recientemente su uso en el tratamiento local de hernias de disco, para degradar (nucleólisis) las glicoproteínas causantes del proceso. La superproducción de proteasas en vegetales está aparentemente restringida a unas pocas familias, entre ellas la familia Bromeliaceae, a la que pertenece el “ihvirᔠo “falso ananᔠ[Pseudoanans macrodontes (Morr.) Harms], a partir de cuyos frutos (semimaduros) se ha aislado y purificado en nuestro laboratorio fitoproteasas con un alto grado de homología en relación a bromelina, la proteasa obtenida tanto de frutos como de tallos del ananá. El extracto crudo que se obtuvo por trituración de los frutos en buffer fosfatos 0,1 M de pH 6, con el agregado de EDTA 5 mM y cisteína 12,5 mM presentó una actividad proteolítica de 4,9 Ucas /ml (utilizando caseína como sustrato). Por otro lado el análisis de la cinética de degradación de sustratos sintéticos del tipo N-carbobenzoxi-p-nitrofenilésteres de L-aminoácidos permitió la determinación de la actividad endoesterásica relativa respecto al aminoácido que aporta el grupo carboxilo. La reacción fue llevada acabo a 37ºC, registrando durante 3 minutos los cambios en la absorbancia a 405 nm, máximo del espectro de absorción del 4-nitrofenolato liberado por la enzima. La unidad enzimática (Ucbz) fue definida como la cantidad de enzima que libera un micromol de p-nitrofenolato por minuto a 37 ºC, a pH 9,0. Las máximas velocidades de degradación se registraron con los derivados de L-alanina, L-lisina y glicina. El análisis del extracto crudo por isoelectroenfoque muestra la presencia de siete fracciones proteicas, de las cuales sólo dos (pI 5,9 y 6,1) son activas. Utilizando cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-sepharose FF, buffer Tris-HCl de pH 7,9, eluyendo con un gradiente de cloruro de sodio 0,05 a 0,15 M) se ha logrado separar estas dos fracciones proteolíticamente activas. El estudio estructural realizado a través de electroforesis bidimensional (nativa-desnaturalizante) demostró la homogeneidad de las fracciones separadas, estando ambas constituidas por una única cadena polipeptídica (Fracción I: 27,8 kDa, Fracción II: 29,5kDa).