Identificación por espectrometría de masa de proteínas diferenciales de dos cepas mutantes de P. aeruginosa, algT y mucA

FERNÁNDEZ, JORGE GERMÁN; HEDEMANN, GABRIELA; LÓPEZ, VERÓNICA; TRIBELLI, PAULA; LÓPEZ, NANCY; MOYANO, ALEJANDRO; SMANIA, ANDREA; VALACCO, PIA

San Luis

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que infecta crónicamente las vías aéreas de pacientes con fibrosis quística. El fenotipo Mucoide, mutante de mucA, marca el inicio de una infección crónica y constituye un signo de mal pronóstico.El gen mucA de Pseudomonas aeruginosa regula negativamente la producción de alginato secuestrando la proteína algT, factor responsable de la transcripción del operón biosintético del alginato.Una de las mutaciones más frecuentes es la denominada mucA22 . Se sabe que esta mutación produce grandes cambios en la bacteria, entre ellos una alta sensibilidad a los nitratos, no siendo viable si adicionalmente se la expone a condiciones anaeróbicas.También está demostrado que la deleción del gen algT, en el fenotipo mucA22 (DalgTmucA22), restaura la resistencia a los nitratos a casi los mismos niveles de la bacteria wild-type, cepa PAO1 en el presente trabajo.Con el objetivo de dilucidar qué cambios se producen en el metabolismo del nitrógeno y en el metabolismo anaeróbico de P aeruginosa se decidió estudiar, por proteómica diferencial, estas dos mutaciones (algTmucA22 y DalgTmucA22) comparándolas contra la bacteria wild type, en condiciones anaeróbicas en presencia de nitrato (control) y de nitrato-nitrito (tratamiento).En el CEQUIBIEM se realiza el análisis Label Free Quantification (LFQ) como rutina. LFQ es una técnica por espectrometría de masa para identificar la expresión diferencial de proteínas entre dos o más condiciones sin utilizar marcajes. En el CEQUIBIEM contamos con un cromatógrafo líquido nano acoplado a un espectrómetro de masa Q Exactive con tecnología Orbitrap que permite, en poco tiempo, identificar cientos o miles de proteínas, dependiendo de la complejidad de las muestras, y permite obtener una abundancia de las mismas, las cuales pueden compararse diferencialmente entre si.Para identificar una mayor cantidad de proteínas se dividió la muestra en tres fracciones subcelulares: citoplasma, membrana y periplasma generadas por ultracentrifugación. Se diseñó un análisis de LFQ para cada tipo de fracción. Los resultados obtenidos de este análisis a la vez de dar información sobre la expresión diferencial de proteínas entre las tres cepas bacterianas, se utilizó para comprobar la eficiencia en la generación y purificación de las fracciones subcelulares.Para analizar los datos generados utilizamos Proteome Discoverer para identificar y cuantificar las proteínas, Perseus para realizar el análisis estadístico que permita encontrar proteínas diferenciales entre las condiciones y R para verificar el rendimiento de los protocolos de fraccionamiento.