Estudios de biosimilaridad de proteína recombinante de bajo peso molecular

MORENO DE COLONNA, SILVIA; VALACCO, MARÍA PÍA; NEME TAUIL, RICARDO MARTÍN; FERNÁNDEZ, JORGE GERMÁN; PAROLA, ALEJANDRO; COUTO, ALICIA

2016-01-01

2016-12-01

Tecnologia sanitaria y curativa-Varios

La empresa interesada en el servicio (en este caso se realiza como una colaboración en el marco de un proyecto PDTS-CIN), nos provee con aproximadamente un miligramo del producto biosimilar que se desea validar, y del producto innovador.Se realizan varios estudios de caracterización de la proteína en cuanto a su masa molecular y secuencia aminoacídica, Para la determinación de masa molecular de la intacta se utilizó el espectrómetro de Masa MALDI TOF TOF (Bruker), y actualmente se está repitiendo la determinación por HPLC, acoplado a MSMS con tecnología Orbitrap (Q Exactive), Para el mapeo peptídico, que pretende cubrir la mayor parte de la secuencia por MS y MSMS, se comenzó realizando digestiones virtuales para determinar enzima óptima para obtener la mayor cobertura posible, usando enzimas que permitan detectar zonas complementarias de la secuencia, y para asegurarnos de cubrir extremos N y C terminales. A partir de este análisis se decidió realizar digestiones enzimáticas de la molécula con varias proteasas de sitio de corte específico.(Tripsina, corta a la derecha de lisinsa y argininas; Quimotripsina, corta a la derecha de triptofano, metionina, fenilalanina, tirosina, leucina; Gluc-c, corta a la derecha de glutámico) y análisis de los fragmentos proteolíticos por MS y MSMS por MALDI TOF y con nanoHPLC, acoplada a Q Exactive para lograr cobertura total de la secuencia con los péptidos identificadosSe logró una cobertura de aproximadamente un 100% por MS y 98% por MSMSEsto se logró gracias a la compra de de la enzima Asp-N, que corta a la izquierda de Asparaginas, que tal como esperábamos permitió lograr el 100% de cobertura por MS.