IDENTIFICACIÓN DE PUENTES DISULFURO EN PROTEINAS CON MÚLTIPLES CiSTEÍNAS

FERNÁNDEZ GERMÁN; MORENO, SILVIA, VALACCO, M.PIA

Los Cocos, Cordoba

Congreso; II Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2014

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

El objetivo de la técnica es identificar la posición de los puentes disulfuro en una proteína. Los puentes disulfuro son de vital importancia en la estructura tri-dimensional de las proteínas. Por lo tanto, identificar la posición de los puentes disulfuro es parte fundamental en la caracterización estructural de proteínas. La técnica consiste en reducir parcialmente los puentes disulfuro que forman las cisteínas de una proteína con el reactivo tris(2-Carboxyehtyl) phosphine hydrochloride (TCEP), en condiciones ácidas. Este reactivo demostró ser un excelente reductor de puentes disulfuro con el cual puede controlarse la cinética para lograr una reducción parcial de puentes disulfuro (10% aproximadamente) Luego las cisteínas libres son cianiladas con el reactivo 1-Cyano-4-dimethylamino-pyridinium tetrafluoroborate (CDAP), el cual tiene un buen rendimiento de cianilación de grupos sulfhidrilo en condiciones ácidas. Finalizada la cianilación, se agrega NH4OH que mediante una ataque nucleofílico al carbono carbonílico unido a la cisteina cianilada y posterior ciclación logra la escisión, dejando un péptido con una cisteína terminal cianilada. El paso final de la técnica es reducir por completo el resto de los puentes disulfuro, para lo cual se puede utilizar TCEP o DTT, indistintamente. Finalmente, estas muestras se analizan por MALDI-TOF y dependiendo de los resultados de m/z obtenidos se puede predecir la ubicación de los puentes disulfuro. Esta técnica sirve para confirmar la posición de puentes disulfuro de una proteína en la cual se presupone donde pueden estar ubicados los mismos. Si no se sabe donde podrían estar ubicados, se puede realizar una separación cromatográfica luego de la cianilación colectando manualmente las diferentes fracciones para luego analizarlas separadamente por MALDI-TOF. Se ilustra el procedimiento con una molécula de 14 aminoacidos, 6 cisteinas y tres puentes disulfuro entrecruzados.