IDENTIFICACIÓN DE PUENTES DISULFURO EN PROTEINAS CON MÚLTIPLES CiSTEÍNAS

JORGE GERMAN FERNANDEZ; SILVIA MORENO DE COLONNA; MARIA PIA VALACCO

Los Cocos

Congreso; II Congreso de la Sociedad Argentina de Espectrometría de masa; 2014

Sociedad Argentina de Espectrometría de masa

El objetivo de la técnica es identificar la posición de los puentes disulfuro en unaproteína. Los puentes disulfuro son de vital importancia en la estructura tri-dimensionalde las proteínas. Por lo tanto, identificar la posición de los puentes disulfuro es partefundamental en la caracterización estructural de proteínas.La técnica consiste en reducir parcialmente los puentes disulfuro que forman lascisteínas de una proteína con el reactivo tris(2-Carboxyehtyl) phosphine hydrochloride(TCEP), en condiciones ácidas. Este reactivo demostró ser un excelente reductor depuentes disulfuro con el cual puede controlarse la cinética para lograr una reducciónparcial de puentes disulfuro (10% aproximadamente)Luego las cisteínas libres son cianiladas con el reactivo 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborate (CDAP), el cual tiene un buen rendimiento de cianilación degrupos sulfhidrilo en condiciones ácidas.Finalizada la cianilación, se agrega NH4OH que mediante una ataque nucleofílicoal carbono carbonílico unido a la cisteina cianilada y posterior ciclación logra la escisión,dejando un péptido con una cisteína terminal cianilada.El paso final de la técnica es reducir por completo el resto de los puentes disulfuro,para lo cual se puede utilizar TCEP o DTT, indistintamente.Finalmente, estas muestras se analizan por MALDI-TOF y dependiendo de losresultados de m/z obtenidos se puede predecir la ubicación de los puentes disulfuro.Esta técnica sirve para confirmar la posición de puentes disulfuro de una proteínaen la cual se presupone donde pueden estar ubicados los mismos. Si no se sabe dondepodrían estar ubicados, se puede realizar una separación cromatográfica luego de lacianilación colectando manualmente las diferentes fracciones para luego analizarlasseparadamente por MALDI-TOF.Se ilustra el procedimiento con una molécula de 14 aminoacidos, 6 cisteinas y trespuentes disulfuro entrecruzados.