Análisis estructural de la interacción entre el dominio de anclaje y dimerización de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae y potenciales péptidos interactores

NICOLAS GONZALEZ BARDECI; FIORELLA, GALELLO; SILVIA ROSSI; SILVIA MORENO

Córdoba

Workshop; 1er workshop argentino de biofisicoquimica de proteínas; 2011

Soc Arg de Fisico quimica y quimica inorganica

La regulación espacial y temporal de la señalización por la proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) está dada por su localización subcelular, que es mediada por proteínas scaffold denominadas AKAPs (A Kinase Anchoring Proteins) La holoenzima tetramérica, catalíticamente inactiva, consta de un dímero de subunidades regulatorias (R) y dos subunidades catalíticas (C) La región de interacción entre las dos R comprende los primeros 45 aminoácidos de su extremo amino terminal, y constituye el dominio de anclaje y dimerización (D/D) cuya estructura corresponde a un arreglo antiparalelo de cuatro hélices. En mamíferos existen cuatro isoformas de R que, si bien difieren en secuencia, presentan un core de interacciones bien conservado. Se han descripto además numerosas AKAPs; todas ellas presentan una pequeña hélice anfipática que interactúa con el dominio D/D de R, formando los complejos de anclaje. Se ha resuelto la estructura de este dominio, tanto en su forma apo como en presencia de distintos péptidos interactores; se conocen por lo tanto los determinantes estructurales que dominan dicha interacción. Sin embargo, hasta la fecha se ha reportado solamente una AKAP en otros organismos (C. elegans) y no se cuenta con información estructural ni del D/D de R ni de su complejo con dicha AKAP. Recientemente hemos identificado varias proteínas “candidatas” a AKAPs en la levadura Saccharomyces cerevisiae, y hemos demostrado la interacción con la subunidad R de la PKA de dicho organismo (bcy1) mediante arrays de péptidos y otros abordajes. Por otro lado, también contamos con un análisis mutacional de la interacción entre dichos péptidos y bcy1, llevado a cabo mediante la misma técnica. El objetivo de este trabajo es avanzar en el entendimiento de la estructura del dominio D/D de bcy1 y analizar los potenciales determinantes estructurales que caracterizan su interacción con las putativas AKAPs de S. cerevisiae. Para ello se realizó en primera instancia un análisis bioinformático de bcy1 así como de los péptidos interactores, junto con experimentos de crosslinking químico a efectos de conocer el estado oligomérico de bcy1 en solución. A continuación se construyeron modelos por homología del extremo amino terminal de bcy1 en su forma apo y en complejo con sus péptidos interactores. Para ello se utilizó el servicio SwissModel de Expasy, y el programa GROMACS para su minimización. Los resultados de los arrays de péptidos fueron analizados a la luz de dichos modelos. El análisis bioinformático muestra que bcy1 presenta los determinantes que han sido reportados como indispensables para la dimerización. Los experimentos de crosslinking químico de la proteína WT y de mutantes de deleción muestran la existencia de un dímero en solución y permiten mapear la región de dimerización en los primeros 85 aminoácidos. El análisis de los modelos permitió obtener información estructural preliminar de la interacción entre bcy1 y sus potenciales interactores. Dicha interacción muestra características únicas, que la distinguen de la interacción conocida en mamíferos, como se deduce de los arrays.