Empleo de un sistema CRISPR-Cas de tipo I-F para la edición de genes en bacterias.

MARÍA CAROLINA MOLINA; CECILIA QUIROGA

Congreso; L Congreso Argentino de Genética; 2022

Sociedad Argentina de Genética

En la naturaleza, los sistemas CRISPR-Cas reconocen y degradan elementos genéticos móviles invasores. Estos sistemas pueden ser reprogramados hacia blancos de interés para silenciamiento temporal o edición de genes. Como objetivo, nos propusimos estudiar el sistema CRISPR-Cas I-F1 de Shewanella xiamenensis Sh95 y evaluar su actividad frente a diversas bacterias. Para ello, se diseñaron y clonaron en el vector pCDFDuet secuencias guías de ARNs de CRISPRs, que provistas en trans reconocen específicamente gfpmut3 del plásmido pBKgfp (KanR), y una guía con una secuencia no complementaria como control. En el entorno nativo, se pudo observar el efecto del sistema sobre gfpmut3 por observación directa al microscopio de epifluorescencia. La cuantificación por fluorimetría arrojó una reducción de los niveles de fluorescencia relativa del ≈ 71.5%. Mediante selección en medio LB con kanamicina se evidenció el curado de pBKgfp, que fue confirmado por PCR. En paralelo, se clonaron los genes del sistema CRISPR-Cas I-F1 en el vector pRSFDuet, en presencia y ausencia de cas2/3 que codifica la nucleasa, con el fin de estudiar su actividad heteróloga en Escherichia coli BL21(DE3). En presencia de Cas2/3 evidenciamos una reducción de la fluorescencia por microscopía. Nuestros resultados sugieren que el sistema CRISPR-Cas tipo I-F1 de S. xiamenensis Sh95 podría ser reprogramado hacia distintos genes blanco y emplearse tanto como herramienta secuencia específica contra patógenos bacterianos, así como también, para manipulaciones genéticas de bacterias de interés biotecnológico e industrial.