“Caracterización de PhoQ, el sensor de Mg2+ en Salmonella enterica”

AMONGERO, MARCELA, CASTELLI, MARÍA EUGENIA, GARCÍA VÉSCOVI, ELEONORA

Rosario

Congreso; Reunión anual Sociedad de Biología de Rosario; 2003

Reunión anual Sociedad de Biología de Rosario

CARACTERIZACIÓN DE PhoQ, EL SENSOR DE Mg2+ EN Salmonella enterica Amongero Marcela, Castelli María E. y García Véscovi Eleonora Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. e-mail: pat-bact@citynet.net.ar Entre los sistemas regulatorios de dos componentes involucrados en virulencia en Salmonella el sistema PhoP/PhoQ reviste particular importancia, ya que controla propiedades patogénicas esenciales de la bacteria tales como las de supervivencia bacteriana en macrófagos, resistencia a péptidos catiónicos microbicidas, e invasión a células epiteliales. PhoQ es la proteína sensora situada en la membrana interna bacteriana, y PhoP el regulador transcripcional citoplásmico. Previamente, identificamos al Mg2+ como la señal ambiental que controla el regulón PhoP/PhoQ y demostramos que este catión interactúa con el dominio periplásmico de PhoQ, induciendo una modificación conformacional del sensor. Más recientemente, examinamos cómo el catión divalente Mg2+ controla finalmente el estado de fosforilación de PhoP, y analizando las diferentes actividades putativas del sensor, demostramos que la interacción del ligando con PhoQ promueve en éste una actividad de fosfatasa específica para fosfo-PhoP. En este trabajo se plantea caracterizar a nivel molecular la modulación del sensor PhoQ por su señal específica Mg2+. El dominio periplásmico de PhoQ fue expresado como péptido aislado, y sus parámetros de interacción con Mg2+ fueron analizadas utilizando técnicas biofísicas (dicroismo circular y fluorescencia intrínseca de triptofanos).  Paralelamente, con el objeto de determinar los residuos aminoacídicos esenciales en la interacción con Mg2+, se realizó mutagénesis al azar y sitio-dirigida de la secuencia que codifica para la región periplásmica de PhoQ y se obtuvieron mutantes alteradas en su capacidad de detección de la señal. La selección de dichas mutantes se efectuó por análisis de complementación in vivo y medidas de actividad de beta-galactosidasa a partir de un gen reportero PhoP-activado. Basándonos en el alineamiento de secuencias con otras histidina-quinasas, se dividió el sensor PhoQ de S. enterica en diferentes sub-dominios y se examinó la  interacción de cada uno de ellos con el regulador de respuesta asociado PhoP.  Mediante ensayos in vitro de retención en columnas de afinidad determinamos que el dominio que alberga la caja H es esencial para el reconocimiento e interacción específica PhoQ-PhoP. Puesto que PhoQ es el primer sensor descripto para Mg2+ extracelular, y PhoP/PhoQ es uno de los pocos sistemas de dos componentes en los que la identidad molecular del ligando está determinada, el análisis del mecanismo que se desencadena a partir de la interacción del mismo con la señal específica constituye un avance en la comprensión de los sistemas de transducción de señales.