Análisis espectroscópico de endoglucanasa en distintos medios

BOGGIONE MARÍA JULIA; MIHOVILCEVIC DAMILA; BISCARI LUCÍA; BASSANI GEORGINA; RODRÍGUEZ FERNANDA; FARRUGGIA BEATRIZ

Buenos Aires

Congreso; XIX Congreso Argentino de Fisicoquímica; 2015

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

Análisis espectroscópico de endoglucanasa en distintos mediosMaría Julia Boggione; Damila Mihovilcevic; Lucía Biscari; Georgina Bassani; FernandaRodriguez; Beatriz FarruggiaIPROByQ. Dpto de Química-Física, Fac. de Cs Bioquímicas y Farmacéuticas. UNRbfarrug@fbioyf.unr.edu.arLa hidrólisis de celulosa es llevada a cabo por un complejo enzimático formado por endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas. Uno de los organismos capaz de degradar celulosa es Aspergillus niger. La utilización de enzimas en la industria está limitada por sus procesos de producción y purificación siendo necesario el desarrollo de métodos económicos y eficientes que permitan obtener grandes cantidades de enzimas a bajo costo (Downstream process). En nuestro grupo hemos desarrollado un protocolo de purificación de endoglucanasa de A. niger utilizando el polímero natural chitosan. Bajo ciertas condiciones, el chitosan y la endoglucanasa forman un complejo insoluble que puede ser separado fácilmente por centrifugación o decantación para luego ser redisuelto cambiando el pH o la fuerza iónica. Dado que durante este proceso de purificación se utilizan diferentes pHs es necesario evaluar su efecto en la estabilidad enzimática y estructural de la endoglucanasa. El objetivo de este trabajofue estudiar el efecto del pH sobre la actividad y estructura de la endoglucanasa utilizando técnicas espectroscópicas. La extinción de fluorescencia aporta información acerca de la accesibilidad del extintor al fluoróforo como también de cualquier cambio que ocurra en el microentorno del triptófano (Lakowicz, 1983). Se determinó la extinción de la fluorescencia de la endoglucanasa con acrilamida a distintos pHs: 3; 4; 5,3 y 6. Los datos se ajustaron con la ecuación de Stern Volmer a partir de la cual se calculó la constante de Stern Volmer (KD). Se obtuvieron valores similares para todoslos pHs analizados salvo para pH 6 donde el valor de KD fue mayor, indicando unamayor accesibilidad de la acrilamida al residuo triptófano de la proteína. Esto último se corrobora al analizar los espectros de emisión de fluorescencia de triptófano. La perturbación de la estructura secundaria de la endoglucanasa llevada a cabo mediante espectroscopía de dicroismo circular (DC) se evaluó a través del contenido de lámina beta (Fasman, 1996). Solo se observó una disminución del contenido de estructura secundaria a pH 6. Además se determinó la actividad enzimática empleando carboximetil celulosa (CMC) como sustrato (Miller, 1959) preincubando la endoglucanasa a distintos tiempos y pHs. No se observó una diferencia significativa cuando la enzima fue preincubada a los distintos pHs estudiados. Podemos concluir que en el rango de pH analizado la enzima es menos estable a pH 6 sin embargo este cambio estructural es reversible dado que la actividad enzimática no se altera cuando la enzima es preincubada a pH 6. Por lo tanto, se pueden utilizar pHs entre 3 y 6 para el desarrollo de procesos de purificación alternativos simples, económicos y escalables para recuperar la endoglucanasa a partir de sus fuentes naturales como por ejemploun cultivo de A. niger.Fasman G. D. (1996) Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules. Plenum Press NY.Lakowicz J.R. (1983) Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press NY.Miller G. L. (1959) Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31 (3),426-428.