Precipitación de celulasa de Aspergillus niger mediante la formación del complejo enzima-polivinil sulfonato de sodio como metodología bioseparativa

BECHER RAMIRO; BOGGIONE MARÍA JULIA; GIORDANO MATÍAS; IMELIO NATALIA; FARRUGGIA BEATRIZ

Casilda

Congreso; XIV Congreso y XXXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012

Sociedad de Biología de Rosario

PRECIPITACIÓN DE CELULASA DE Aspergillus niger MEDIANTE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO ENZIMA-POLIVINIL SULFONATO DE SODIO COMO METODOLOGÍA BIOSEPARATIVA. Ramiro Becher, María Julia Boggione, Matías Giordano, Natalia Imelio; Beatriz Farruggia. Área Fisicoquímica. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. U.N.R ? CONICET - CIUNR. bfarrug@fbioyf.unr.edu.arUn proceso biotecnológico global incluye la producción de organismos, manipulados o no, su utilización o la de moléculas biológicas, las que deberán ser aisladas del medio donde son producidas. La bioseparación de las proteínas específicamente es uno de los pasos más costosos del proceso de obtención. La precipitación con polielectrolitos (PE) ofrece la posibilidad de llevar a cabo una adecuada purificación, o al menos la concentración de la enzima de interés en las primeras etapas. Esto se debe a que requiere bajas concentraciones de polímero, es un proceso simple, rápido y con posibilidades de ser llevado a cabo en gran escala, conduciendo a metodologías industriales limpias. Las celulasas (CEL) son enzimas claves desde el punto de vista biotecnológico por sus aplicaciones en las industrias alimenticia, textil, del papel, para la fermentación de biomasa en biocombustibles y en aplicaciones farmacéuticas así como en investigaciones biológicas.El objetivo de este trabajo fue estudiar la formación de complejos entre una celulasa producida por Aspergillus niger y polivinil sulfonato de sodio (PVS) como punto de partida para aislar dicha proteína desde distintos caldos de cultivo de diferente origen fúngico. Además de la celulasa de Aspergillus niger se produjo la enzima a partir de Trichoderma sp. y fue estudiada la estabilidad celulolítica en diferentes condiciones. La formación de complejos entre una celulasa proveniente de un liofilizado comercial (Ly) y el PVS es altamente dependiente de las condiciones del medio (pH, fuerza iónica, temperatura). La medición de la turbidez a 420 nm permite seguir la formación del complejo para las diferentes condiciones estudiadas: turbidez en un rango de pH de 1 a 9, para concentraciones de liofilizado desde 15 hasta 40 mg/mL y para concentraciones de soluciones de polímero desde 0.5 hasta 2% P/P y a diferentes fuerzas iónicas dadas por NaCl de 0.25 hasta 1 M. La determinación de la actividad enzimática de la celulasa permite medir la capacidad del método para proteger la actividad biológica. Se comprobó que la presencia del polímero no afecta la actividad enzimática bajo las condiciones de trabajo elegidas (Fig 1). Los diagramas de fases mostraron que el complejo CEL-PVS es insoluble a pHs menores que 3,0 y se forman a partir de una relación de 0,005 mg de PVS/mg de liofilizado (Fig 2). La redisolución del precipitado fue ensayada por efecto de la fuerza iónica (Fig 3) y por efecto del pH del medio. Los resultados obtenidos permitieron diseñar un primer paso separativo teniendo en cuenta las características de formación-disociación del complejo. Fueron calculados los rendimientos y factores de purificación (Fig 4 y 5) para diferentes tiempos de incubación de acuerdo a las condiciones ensayadas. Esta metodología será aplicada a la bioseparación de celulasa a partir de un medio de cultivo de Aspergillus niger en medio sólido con cáscara de soja como soporte y fuente de carbono.Fig 1: Estabilidad de la celulasa de 30 mg/mL de Liofilizado comercial, pH 2.7, T: 15°C, 15 min.Fig 2: Efecto del pH sobre la enzima, el polímero y el complejo PVS-LyFig 3: Formación del complejo en presencia de distintas fuerzas iónicas dadas por NaCl Fig 4: Rendimiento en el precipitado y en el sobrenadanteFig 5: Purificación en el precipitado y en el sobrenadante