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PRODUCCIÓN DE CELULASA DE Aspergillus niger EN MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDO DE OLOTE DE MAÍZ BLANCO Y SU EXTRACCIÓN UTILIZANDO SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS. Boggione, María Julia; Gómez García, Ricardoa; Aguilar González, Cristóbal Noea, Farruggia, BeatrizIPROByQ. ?Laboratorio de Fisicoquímica aplicada a la bioseparación? Área Fisicoquímica. Departamento de Química Física de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR aDto. Inv. Alimentos. F.Cs.Qcas. U.A.Coahuila. Mx mboggione@fbioyf.unr.edu.arLa celulasa es un complejo enzimático capaz de degradar celulosa. Está conformado por la endo-1,4-β-D-glucanasa, la exo-1,4-β-D-glucanasa y la β-D-glucosidasa. Son enzimas de importancia biotecnológica por sus aplicaciones en las industrias alimenticia, textil, del papel, para la fermentación de biomasa en biocombustibles y en aplicaciones farmacéuticas así como en investigaciones biológicas. La producción en cultivos en medio sólido, tiene como ventaja respecto de los medios líquidos, el bajo consumo de agua y la posibilidad de utilizar desechos agroindustriales como fuentes de carbono ysoportes de crecimiento. En biotecnología los hongos se utilizan como fuente enzimática debido a la alta disponibilidad y estabilidad. Aspergillus niger es un hongo productor de celulasa muy utilizado industrialmente. El objetivo del presente trabajo fue producir celulasas a partir de desechos agroindustriales. Para la producción se utilizó cultivo un medio sólido de marlo de maíz blanco. Se llevó a cabo un estudio cinético del crecimiento del hongo sobre el soporte. Se determinó pH, proteínas, actividad enzimática cada 12 horas durante 96 horas desde el momento del agregado del inóculo. Para determinar actividad celulasa se realizaron determinaciones cuantitativas y cualitativas de las 3 enzimas que forman el complejo. El pH del cultivo se mantuvo en un rango de 3.8 - 4.8 observándose un mínimo a las 36 h. Se determinó actividad endoglucanasa por método cualitativo en placas de agar utilizando carboximetilcelulosa como sustrato y rojo congo para revelar la actividad. Se obtuvieron halos claros de mayor diámetro a mayores tiempos del cultivo aunque la actividad no pudo ser cuantificada, probablemente debido al alto contenido de azúcares del medio. Se obtuvo la máxima actividad exoglucanasa (papel de filtro Whatman Nro.1) y β-glucosidasa (sustrato p-nitrofenil β: 1-4 glucopiranósido) a las 60 h, siendo de 190.75 U/L y de 430.46 U/L respectivamente. A las 96 h se obtuvo la máxima cantidad de proteína siendo de 0.7973 mg/g de soporte. La actividad específica fue máxima a las 36 h para exoglucanasa y a las 60 h para β-glucosidasa siendos éstas de 0.6136 U/mg y 1.8838 U/mg respectivamente. Se determinaron la productividad volumétrica y específica de exoglucanasa y β-glucosidasa. La productividad volumétrica resultó máxima a las 60 h para exoglucanasa y β-glucosidasa, siendo de 3.1792 U/L h y 12.99 U/L h respectivamente. La productividad específica de exoglucanasa fue máxima a las 36 h, siendo de 3.32 10-2 U/ mg h. La productividad específica de β-glucosidasa alcanzó el máximo a las 60 horas, obteniéndose un valor 3.14 10-2 U/ mg h.El proceso de recuperación, purificación y separación de las enzimas producidas por acumulación extracelular durante el cultivo en estado sólido fue abordado utilizando sistemas bifásicos acuosos (SBAs) los cuales representan una técnica bioseparativa atractiva cuando no es necesaria una alta pureza, o en los pasos iniciales de purificación. Las ventajas se centran en la baja tensión interfacial y alto contenido de agua, lo cual provee de un ambiente favorable para la preservación de la actividad biológica de moléculas lábiles (Carvalho et al. 2007). Existe poca información sobre la aplicación de los SBAs para la purificación y separación de la celulasas y xilanasas. Los SBA se pueden formar al mezclar en medio acuoso dos polímeros decadena flexible (PCF) o bien un PCF y alguna sal (fosfato de potasio, sulfato de sodio, etc) por encima de cierta concentración crítica. La purificación se logra por un reparto diferenciado de la molécula blancoy las impurezas entre ambas fases acuosas. La elección de las condiciones experimentales adecuadas permitirá emplear los SBA para extraer una proteína blanco de una mezcla compleja, haciendo que dicha molécula se repartamayoritariamente hacia una de las fases y las que constituyen sus impurezashacia la fase contraria.En este caso se utilizaron sistemas formados por polietilenglicol de diferentes masas molares (600, 3350 y 8000) y sales como fosfatos (Pi) y citrato (Ci) de potasio para formar los sistemas bifásicos. En ellos se produjo el reparto de un liofilizado comercial y el filtrado proveniente del medio de cultivo sólido, fueron determinadas en ambas fases las enzimas del grupo de las celulasas y las proteínas totales en todos los casos. Fueron determinados los porcentajes de rendimientos (%R) en las fases y los factores de purificación (FP) de la enzima correspondiente.Con el liofilizado comercial los mejores resultados de purificación y recuperación se obtuvieron, para la exoglucanasa, en las fases inferiores de los sistemas PEG8000/Pi y PEG3350/Ci % de rendimientos del 70% y FP de 4.5 y 6.5 respectivamente.Para la endoglucanasa en la fase superior de los sistemas PEG600/Pi y en la fase inferior de los PEG8000/Ci los %R en la fase inferior fueron superiores al 80 % aunque con bajos FP.La producción de celulasa fue exitosa en cultivos económicos en medio sólido los cuales requieren bajo consumo de agua, son fuente de carbono y soporte simultáneamente, en este caso utilizando marlo de maíz como producto de desecho. Los resultados además indican que la extracción selectiva de los cultivos podría mejorar las condiciones de una futura purificación de las diferentes enzimas que conforman el complejo celulolítico utilizando SBA.

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