Adsorción de Proteínas de interés industrial en Matrices de Chitosán

BOGGIONE MARÍA JULIA; IMELIO NATALIA; LO MENZO FERNANDO; SPELZINI DARÍO; FARRUGGIA BEATRIZ

San Luis

Workshop; Workshop sobre Adsorción, Adsorbentes y sus Aplicaciones; 2014

INFAP-CONICET-UNSL

ADSORCIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERÉS INDUSTRIAL EN MATRICES DE CHITOSÁN María Julia Boggione, Natalia Imelio, Fernando Lo Menzo, Darío Spelzini y Beatriz Farruggia.Lab. Fisicoquímica Aplicada a la Bioseparación. Fac. Cs. Bioq. y Farm. Suipacha 531 2000 Rosario U.N.R. FonCyT. CONICET. CIUNR. bfarrug@fbioyf.unr.edu.arIntroducción: La purificación de proteínas representa una instancia costosa en diversos procesos biotecnológicos, lo cual hace imprescindible el desarrollo de técnicas de separación y concentración enzimática. La adsorción en matrices de polielectrolitos (PE) es una técnica de bioseparación que se basa en la adsorción enzimática en una matriz. Permite capturar las macromoléculas procedentes de un extracto de partida sin necesidad de tratamientos previos, la concentración del producto deseado en una única operación con rendimientos adecuados y en tiempos reducidos. De las interacciones proteína-polímero existentes, se acepta que las interacciones electrostáticas juegan un rol preponderante en la adsorción.Las lipasas (EC 3.1.1.3) (pI=4.8) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis y síntesis de trigliceraldehídos in vivo. La celulasa (EC 3.2.1.4) (pI=4.8) es un complejo enzimático capaz de degradar celulosa. Ambas enzimas tienen gran importancia biotecnológica por sus aplicaciones en las industrias alimenticia, textil, del papel, para la fermentación de biomasa en biocombustibles y en aplicaciones farmacéuticas así como en investigaciones biológicas.Los hongos son una fuente importante de enzimas para su uso en biotecnología debido a la alta disponibilidad y estabilidad enzimática. El Asperghillus niger es un hongo productor de lipasa y celulasa muy utilizado industrialmente. El chitosan es un polielectrolito básico no tóxico producto de la desacetilación de la quitina con el cual es posible fabricar matrices adsorbentes que portan cargas positivas.Objetivo:El objetivo del trabajo es caracterizar la adsorción de lipasa y celulasa proveniente de un medio de cultivo sólido de A. niger en matrices insolubles de chitosan. Metodología: Se trabajó con liofilizados comerciales de ambas enzimas adquiridos en Sigma. La matriz fue prepara por extrusión de una solución de chitosan 3% sobre una solución de NaOH. Las esferas fueron lavadas con agua destilada y conservada en buffer fosfato (Pi) 25 mM pH 7. La actividad lipolítica y celulósica se determinaron espectrofotométricamente usando ácido p-nitrofeniláurico (pNPL) y carboximetilcelulosa (CMC) como sustratos respectivamente. Las proteínas totales se midieron por el método de Walburg y estas dos determinaciones se utilizaron para todo el seguimiento del proceso.La producción de ambas enzimas se llevó a cabo en dos sistemas de cultivo: cultivo en medio sólido de desechos agroindustriales y cultivo líquido sumergido tomados como control de comparación. Se utilizó la cepa NRRL3 de A. niger para la producción de ambas enzimas. Resultados y conclusiones:Con el liofilizado comercial se determinó la cinética de adsorción de las dos enzimas a estudiar (lipasa y celulasa) en las matrices de chitosán en los buffers adecuados a 25°C para varias concentraciones de enzima. En ambos casos la adsorción sigue una cinética de doble decaimiento exponencial. En el caso de la lipasa se alcanza un 75-80% de adsorción de enzima y 40-60% de adsorción de proteínas. En el caso de la celulasa, los rendimientos de adsorción son menores.Las curvas de desorción a distintas fuerzas iónicas indican que la interacción de ambas enzimas y el chitosán es electrostática, la saturación de la matriz se alcanza en menos de diez minutos para la lipasa y en 20 minutos para la celulasa, y aumenta con la superficie de adsorción. Los equilibrios de adsorción ajustaron a Isotermas de Langmuir a las diferentes temperaturas de trabajo en todos los casos. La capacidad máxima de adsorción de la matriz no resulta constante, respecto de la temperatura, para ninguna de las enzimas.A partir de los valores de las constantes de afinidad, aplicando la ecuación de Van?t Hoff, se calculó la entalpía del proceso de adsorción: en el caso la lipasa resulta exotérmica y la de la celulasa es endotérmica, son bajas, ambas del orden de las 7 Kcal/mol. Ha resultado exitosa la producción enzimática en los medios sólidos ensayados de pellet de soja en el caso de la lipasa y de cascaras de limón para el caso de la celulasa. Las adsorciones de la lipasa y la celulasa en matrices de chitosán desde esos caldos de cultivo serán encarados teniendo en cuenta estos resultados sobre el liofilizado comercial.