Un ensayo competitivo amperométrico para la detección de endotoxinas

G. PRIANO; F. BATTAGLINI

Merlo, San Luis

Congreso; 3er Congreso Argentino de Química Analítica; 2005

Asociación Argentina de Químicos Analíticos

Las endotoxinas, también llamadas lipopolisacáridos (LPS) debido a su estructura química, son constituyentes de la membrana externa de las Bacterias Gram-negativas.  Ellas son responsables de generar fiebre y un cuadro clínico denominado shock séptico, cuando ingresan al torrente sanguíneo.  El shock séptico es causa de unas 200.000 muertes al año en EE.UU. y se caracteriza por la disfunción progresiva de los órganos principales. El método que se utiliza habitualmente para la detección de endotoxinas en agua es el LAL Test (del Lisado de Amebocitos del Limulus Polyphemus o Cangrejo Herradura) basado en la coagulación o gelificación de este lisado en presencia de endotoxinas.  Este método es altamente variable, de costoso equipamiento y en caso de discrepancias la FDA recomienda el ensayo de endotoxinas en conejos. En este  trabajo se presentará la base conceptual y avances alcanzados en el diseño de un ensayo de tipo competitivo, con transducción electroquímica para la detección de endotoxinas en agua de diálisis. El ensayo se basa en la utilización de una proteína antimicrobiana recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente una porción del LPS para la construcción de los electrodos modificados y de un conjugado de LPS con la enzima HRP para el ensayo competitivo.  Dos configuraciones de electrodos modificados fueron construidas a partir de diferentes métodos de inmovilización: un autoensamblado electrostático, donde ENP es incorporada a través de las interacciones electrostática e hidrofóbica entre la proteína y un polímero electroactivo adsorbido sobre el electrodo y una configuración covalente, donde ENP se encuentra unida covalentemente a una matriz de carboximetildextran unida al electrodo de oro también covalentemente.  La incorporación de los distintos componentes al electrodo fue seguida a través de técnicas electroquímicas y elipsometría. El autoensamblado electrostático permite detectar la presencia de endotoxinas en concentraciones tan bajas como 0.2 EU mL-1, por debajo del límite de 0,25 EU mL-1 establecido por la Farmacopea Americana para inyectables. Con la configuración covalente se obtiene una mejor respuesta, un rango dinámico más amplio pero también un mayor límite de detección.