Aptámero de adenosina y secuencias complementarias: estrategias para el desarrollo de señal.

HELENA CERRETI; M. B. PONCE; F. BATTAGLINI; S. RAMIREZ; J. MONTSERRAT

Mendoza

Congreso; 7mo Congreso Argentino de Química Analítica; 2013

Asociación Argentina de Químicos Analíticos

l aptámero obtenido por Szostak [1] mediante la metodología de SELEX consiste en una secuencia de ADN simple cadena (ss) de 27 nucleótidos que posee alta afinidad por adenosina, AMP y/o ATP. El reconocimiento del analito implica un cambio conformacional en la estructura del aptámero, el cual puede aprovecharse para desarrollar una señal con fines analíticos. El interés de este sistema modelo [2] radica en el desafío de detectar moléculas pequeñas, como lo son la adenosina, AMP o ATP. La metodología puede ser extrapolada a otros analitos de interés en matrices complejas como las ambientales o biológicas.A su vez, los aptámeros, tienen capacidad para unirse a secuencias complementarias de ADN formando estructuras doble cadena (ds). La competencia por el aptámero entre el analito y la secuencia complementaria puede traducirse en una señal cuantificable. Dentro de las variables que afectan dicha competencia se encuentran: la longitud de la secuencia complementaria (temperatura de fusión, Tm), la fuerza iónica del medio, la presencia de cationes divalentes (Mg2+), el pH, la temperatura, el tiempo de incubación, y la relación de concentración analito-oligonucleótido ds.Se prepararon dos estructuras ds a partir de secuencias complementarias de 11 y 27 nucleótidos con las cuales se ensayó la competencia frente a adenosina y AMP, ajustando las variables mencionadas. El seguimiento se hizo por electroforesis (PAGE) en condiciones no desnaturalizantes. Fue posible detectar la separación de las estructuras ds en presencia de adenosina y AMP, lo cual evidencia la afinidad del aptámero por su analito. En cambio la incubación con 2-desoxiguanosina, una molécula pequeña de estructura similar, no mostró cambios.Con el fin de explorar técnicas más sensibles, las secuencias ds obtenidas, se inmovilizaron sobre superficies de Au [3] empleando una modificación química disulfuro (-S-S-). Se estudió la respuesta electroquímica frente a diferentes concentraciones de analito por impedancia, CV y SWV empleando un mediador redox en solución ([Fe(CN)6]-4/-3).