Optimización del sistema de transformación genética mediante Agrobacterium tumefaciens de limonero Eureka

ROMERO A.L., SENDÍN L.N., FILIPPONE M.P., ORCE I.G., MARANO M.R., VOJNOV A.A. Y CASTAGNARO A. P.

Congreso; VI Congreso Argentino de Citricultura; 2010

La transformación genética es una valiosa herramienta para el mejoramiento de especies leñosas, en las cuales los métodos convencionales son obstaculizados por largos períodos de juvenilidad, heterocigocis, poliembrionía, etc. En la EEAOC se trabaja en la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens de limonero Eureka. En genotipos recalcitrantes como esta variedad, la etapa critica de la trasformación es la regeneración “in vitro" de plantas a partir de células transformadas. En nuestro laboratorio se optimizó un medio de cultivo que permitió obtener un  40% de regeneración en tejido juvenil, con el que se iniciaron ensayos de transformación. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dos cepas de Agrobacterium y del tamaño del explanto en la eficiencia de transformación. Segmentos de epicótilo de 3 y 15 mm de longitud se inocularon con una suspensión de las cepas EHA105 o AGL1, portadoras del gen reportero de la β-glucuronidasa (uidA). Después de 60 días, se observó que la eficiencia de regeneración disminuyó en los explantos inoculados con respecto a los no inoculados. Los explantos de 3mm mostraron una fuerte oxidación independientemente de la cepa de Agrobacterium utilizada. Mediante tinción histoquímica de la actividad del transgén reportero, se determinó que ambas cepas de Agrobacterium fueron igualmente efectivas en la transformación de cada tipo de explanto, aunque el número de explantos con puntos azules fue mayor en los de 15 mm (40-50%) que en los de 3 mm (25-30%). La naturaleza transgénica de los brotes regenerados se confirmará cuando alcancen un tamaño adecuado.