Identificacion y caracterización de enzimas ligninoliticas en hongos de pudrición blanca de Misiones, Argentina.

FONSECA, MARÍA I; GIORGIO ERNESTO M; VILLALBA LAURA L; ZAPATA, PEDO D

Posadas

Jornada; VII Jornadas de Ciencia y Tecnología de la Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales, UNaM.; 2009

Los hongos de pudrición blanca poseen un sistema enzimático cuyas enzimas hidrolíticas y oxidativas actúan en la degradación de componentes de la pared celularcomo la lignina, celulosa y hemicelulosas. Son los únicos capaces de secretar enzimasoxidativas capaces de mineralizar la lignina hasta dióxido de carbono y agua. Para llevara cabo la degradación de la lignina los distintos hongos ligninolíticos poseen un complejoenzimático con distintas funciones. Las enzimas oxidativas más ampliamente distribuidasson la Lignina peroxidasa (Lip), Manganeso peroxidasa (MnP) y Lacasa (Lac). Laproducción de enzimas del tipo fenol-oxidasas es lo que distingue a los hongos depudrición blanca (HPB) de los demás basidiomicetes degradadores de madera ycausantes de otros tipos de pudrición.  El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del aserrín sobre la actividad de laenzima lacasa y obtener un fragmento del gen en el hongo T villosa. Se extrajeron 6 tacos de 6 mm de diámetro a partir de cultivos del hongo, para locual se lo hizo crecer en placas de agar 10 (g/L) con extracto de malta (12g/L) y luego seinocularon en cultivos líquidos a pH 5,5  conteniendo 12.7 (g/L) extracto de malta  y 5(g/L) de extracto soluble de maíz. Posteriormente se incubaron 3 días bajo agitación a 50rpm para ser luego transferidos a frascos conteniendo 25 g de aserrín de madera de pino(Pinus taeda) con una de humedad de 60% manteniéndolos a 29 ± 1º C en condicionesestáticas por 32 días. Estos ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. Las enzimasfueron extraídas mediante dos lavados a 20ºC en condiciones estáticas durante 5 y 8horas con 50 mM de buffer acetato de sodio pH 5,5 y Tween 20 (0,1 g/L). Para cadatiempo de extracción se extrajeron sobrenadantes del fluido extracelular recolectado ycentrifugado con el objetivo de determinar la actividad enzimática. La actividad de lacasase midió a 30ºC mediante espectrofotometría a 469 nm usando 5 mM de DMP(Dimetoxifenol) en 0,1 M de buffer acetato de sodio (pH 3,6). El análisis estadístico fuellevado a cabo con el programa GraphPad Prism. Para la amplificación por PCR se extrajoADN de micelio cuyos productos fueron mandados a secuenciar y analizados medianteBlastn. Se encontraron diferencias significativas (P<0.001) en la actividad enzimática delacasa entre las dos extracciones realizadas a diferentes tiempos. La actividad  luego de8 h de extracción fue seis veces mayor (1566 U) que luego de 5 h (243 U). Se obtuvieronfragmentos de 200 pb los cuales mostraron un 80 % de identidad con lac2 de Trametespubescens. Estos relevantes resultados motivan y requieren la profundización de estudios másextensos donde se incluyan otras variables para obtener las condiciones óptimas deproducción enzimática tendientes a la aplicación en procesos biotecnológicos relacionadosa la industria celulósica-papelera.