Desarrollo de vacunas recombinantes preventivas para el control de Caligus rogercresseyi en salmones

POGGIO, THELMA VERÓNICA; JOSE LA TORRE; EDUARDO ALBERTO SCODELLER

Mar del Plata

Jornada; 6tas. JORNADAS INTERNACIONALES DE VETERINARIA PRÁCTICA Pequeños y Grandes Animales; Producción Avícola; Bromatología y Tecnología de los Alimentos; 2010

Colegio de Veterinarios Provincia de Bs As

PARASITOLOGÍADesarrollo de vacunas recombinantes preventivas para el control de Caligus rogercresseyi en salmonesDra. POGGIO, Thelma1, Dr. SCODELLER Eduardo2, Dr. LA TORRE José1.1CEVAN-Centro de Ciencia y Tecnología ?Milstein?- CONICET2Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo (IMBECU)-CONICETvpoggiocevan@centromilstein.org.arINTRODUCCIÓNEl copépodo de la familia Caligidae, Caligus rogercresseyi comunmente llamado piojo de mar es el ecoparásito dominante en las especies de salmones silvestres y cultivables que afecta a la salmonicultura chilena.Con el crecimiento mundial del cultivo intensivo de salmónidos y a medida que se incrementan los niveles de producción, los perjuicios mas importantes que presenta la infestación por Cáligus son los siguientes: altas tasas de mortalidad, reducción de la tasa de crecimiento de los peces en cultivo y la calidad de los mismos debido al daño en la musculatura que lleva a una pérdida de valor comercial, incremento de los costos de producción debido al costo del tratamiento para combatir la plaga y las diversas enfermedades asociadas, resistencia del piojo de mar a los químicos terapéuticos y toxicidad de éstos productos sobre la vida marina.Un intento de reducir la incidencia de enfermedades parasitarias en los salmónidos podría ser implementado mediante el desarrollo de un método alternativo que induzca la protección adecuada de los peces a la infestación por copépodos y por sobre todo minimice el uso de químicos.Numerosa evidencia experimental acumulada en los últimos años demuestra que es posible inducir la activación de la inmunidad innata y adaptativa a través del protocolo prime & boost. Debido a que en su ciclo de vida normal, Cáligus, puede no exponer todos sus componentes inmunogénicos, se analizó el perfil diferencial de reactividad antígeno-anticuerpo ligado a la infestación natural y se comparo con el patrón observado en especies inmunizadas con extractos de Cáligus con el objetivo de detectar potenciales antígenos ocultos. Se compararon los perfiles de las especies mas sensibles (trucha arcoiris) y mas resistentes (salmon coho) a la infestación. Una vez caracterizadas las diferencias de inmunoreactividad, se diseño una estrategia de inmunización basada en el uso de vectores virales como fuente de ADN (prime) y, los potenciales antígenos ocultos combinados con un adyuvante mucosal como refuerzo (boost).En el presente trabajo se testeo la respuesta inmune y el grado de protección, posterior al desafío con el patógeno, de truchas arcoiris mantenidas en estanque e inmunizadas con esta estrategia.MATERIALES Y METODOSObtención de antigenos proteicos:Se analizo el patrón de proteínas resultante de la migración electroforética en gel de poliacrilamida- dodecilsulfato de sodio, de un extracto de Caligus rogercresseyi. Posteriormente se realizó la electrotransferencia del gel a una membrana de nitrocelulosa y fracciones de éste soporte se incubaron con suero y mucus de trucha arcoiris y salmo coho infestados naturalmente o inmunizados con extractos de Cáligus. Los controles se realizaron en las mismas especies libres de infestación. Las bandas reactivas fueron reveladas por quimioluminiscencia y una vez caracterizadas las proteínas diferenciales, se electroeluyeron del patrón de migración de un extracto de Caligus rogercresseyi. Se realizó la cuantificación densitométrica y se ajustó la concentración con buffer de formulación para su posterior uso como inmunógenos Plan de inmunización:Cuatro grupos de 20 truchas arcoiris de 10 μg libres de infestación fueron mantenidas en estanques con agua dulce y alimentadas a ?ad libitum?. Un grupo fue inmunizado 100μg del plásmido vector Semliki Forest virus-LacZ, como fuente de DNA por vía intramuscular y previo al pasaje a agua salada fueron inoculadas con 5 μg de antígenos proteicos formulados con hemocianina como adyuvante por via intraperitoneal. El segundo grupo solo recibió dos dosis de 5 μg de los antigenos proteicos mas hemocianina.Los otros dos grupos sirvieron como controles y solo recibieron dosis de adyuvante y buffer fosfato respectivamente. A los 30 días posteriores al traspaso a agua de mar, se realizo el desafío con 4000 copepoditos/estanque y se determino la carga parasitaria promedio de los peces desafiados.Se tomaron muestras séricas y de mucus a tiempo 0 y al desafío para determinar la respuesta inmunológica a la vacunación. RESULTADOSAl analizar el perfil de antigenos-anticuerpos inducidos por la infestación natural de las especies blanco y el patrón inducido en peces inmunizados con extracto crudo de Cáligus, se determino que existían importantes diferencias y esa inmunoreactividad diferencial podría estar asociada la detección de antígenos potencialmente ocultos. Suero y mucus de salmón coho inmunizado con extracto de Cáligus reconocen proteínas de mediano peso molecular que no son detectadas por los mismos líquidos biológicos extraídos de trucha arcoiris y salmon coho altamente infestados ni de los controles sin infestar. Estos potenciales inmunógenos, formulados con un adyuvante mucosal, sirvieron para reforzar la respuesta inmunológica desencadenada por la administración del plásmido vector viral utilizado como fuente de ADN. La formulaciones administradas a los dos grupos resultaron altamente inmunogénicas y se observo reducción de la carga parasitaria post-desafío con respecto a los controles. DISCUSIONLos mecanismos de inmunidad innata, altamente desarrollados en peces, están involucrados en la resistencia a la infestación a través de la activación de la respuesta inmune celular y humoral no específica como primera barrera de defensa contra microorganismos infecciosos.Por lo tanto, a través de la inmunización con plásmido vector como fuente de ADN se pudo inducir una respuesta inmune humoral y celular completa y sostenida así como también mecanismos de defensa no-específicos en el sitio de inyección que pudieron ser reforzados por la inmunización con los potenciales antígenos ocultos destinados a inducir inmunidad específica. Cabe destacar que la construcción del plásmido vector Semliki Forest virus que porta el gen LacZ (etapa priming) ha sido desarrollada en nuestro laboratorio para éste fin.En una segunda instancia se determinará la secuencia amino terminal de los antígenos seleccionados para determinar su homología con proteínas conocidas y se procederá al diseño de genes sintéticos y su clonado en vectores adecuados para la expresión de los antígenos como proteínas de fusión y su utilización como boosters. CONCLUSIONESSe concluye que existen importantes diferencias en la caracterización inmunológica de proteínas de Cáligus que podrían estar vinculadas a la protección de especies de salmónidos mas resistentes a la infestación natural. La estrategia de prime & boost diseñada para reducir la incidencia de infestación por C. rogercresseyi en salmonidos de cultivo es promisoria y constituye el primer reporte del desarrollo de una vacuna de ADN recombinante contra Cáligus ya que no existen vacunas disponibles en el mercado ni antecedentes de desarrollo de vacunas tradicionales ni de ingeniería genética en la bibliografía.La vacunación de salmones de cultivo constituye el enfoque alternativo mas racional para controlar la plaga y por sobre todo ayuda a minimizar el uso de antiparasitarios y sus efectos.